维A酸对人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的影响

               作者：牛新武，冯捷，彭振辉，马惠群，刘超，张宪旗

【关键词】  细胞分裂

    Effects of retinoids on proliferation of human melanoma cell line A375

　　【Abstract】 AIM:  To investigate the effects of diverse retinoids and receptor agonists in inhibiting proliferation of human melanoma cell line A375. METHODS:  Human melanoma cell line A375 was treated by diverse retinoids (atRA, 13cis RA and 9cis RA), MA (RXR agonist) and TTNPB (RAR agonist) and their effects on the proliferation and cell cycle of A375 cells were analyzed by MTT and flow cytometer. RESULTS:  Both retinoids and TTNPB inhibited the proliferation of A375 cells, but MA had no such effect. At all concentrations (10-5, 10-6 and10-7 mol/L) in 24 h and 10-5 mol/L in 48 and 72 h, TTNPB had the most powerful effect in all reagents (P<0.05). The results of cell cycle analysis showed that retinoids and TTNPB caused the blockage of G0/G1 phase, but MA had no such effect. At 10-5 mol/L in 24 and 48 h, TTNPB had the most powerful effect of causing blockage of G0/G1 phase in all reagents (P<0.05). CONCLUSION:  Retinoids can inhibit the proliferation and cause the blockage of G0/G1 phase in human melanoma cell line A375. It is not the activation of RXR but the activation of RAR that may be related to these effects.

　　【Keywords】 retinoids; melanoma; A375 cells; cell division

　　【摘要】 目的： 研究维A酸(RA)抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的作用. 方法： 用RA（atRA, 13cisRA和9cisRA）、MA（RXR激动剂）及TTNPB（RAR激动剂）处理培养的人类恶性黑色素瘤A375细胞. 用MTT法研究这些试剂对细胞增殖的影响，用流式细胞仪研究这些试剂对细胞周期的影响. 结果： RA和TTNPB均可抑制A375细胞的增殖，而MA无此作用. 在作用24 h时的不同浓度（10-5, 10-6和10-7 mol/L）以及作用48和72 h的10-5 mol/L浓度时，TTNPB的抑制增殖作用均强于其它试剂处理组（P<0.05）. 细胞周期分析结果显示RA和TTNPB均可诱导A375细胞G0/G1期阻滞，而MA无此作用. 在作用24和48 h时的10-5 mol/L浓度时，TTNPB的诱导G0/G1期阻滞作用均强于其它试剂处理组（P<0.05）. 结论： RA可抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞的增殖，并诱导G0/G1期阻滞. RA的这些作用与RXR的激活无关，而可能与RAR的激活有关.

　　【关键词】 维生素A酸类；黑色素瘤；A375细胞；细胞分裂

　　0引言
 
　　恶性黑色素瘤是常见的皮肤恶性肿瘤，近年来发生率有增长趋势［1］,但至今尚无有效的方法. 维A酸(RA)能够抑制多种恶性肿瘤细胞株的生长，并且可诱导其向正常细胞分化［2］. RA在体内主要是通过RA受体（RAR）和RA X受体（RXR）发挥多种生理或药作用的. 然而，RA抑制肿瘤细胞增殖的作用与RAR和RXR的关系至今尚不清楚. 本实验中，我们研究了3种RA和2种RA受体激动剂对人类恶性黑色素瘤A375细胞株的抑制作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人类恶性黑色素瘤A375细胞株（西安大学第二皮肤科冉立伟博士惠赠）.  全反式RA（atRA）、13顺RA（13cisRA）、9顺RA（9cisRA）、Methoprene acid（MA, RXR激动剂）、TTNPB (RAR激动剂)、二甲基亚砜（DMSO）购于美国Sigma公司. 所有RA以10-2mol/L浓度溶于DMSO，-70℃避光保存. MTT购于中山公司. 细胞培养所需的主要试剂为Gibco产品. 高通道多功能微板测试系统（德国BMG公司）. FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）.

　　1.2方法

　　人类恶性黑色素瘤A375细胞于含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640（含1×106 u/L青霉素和1×106 u/L 链霉素）中培养. 在37℃, 50 mL/L CO2条件下进行细胞培养. 当细胞生长达到70%～80%融合时，胰酶消化并传代细胞. 将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，于细胞培养箱中孵育4 h后取出，加入各种试剂及100 mL/L FBS RPMI 1640. 每孔液体总量最终为200  μL，试剂终浓度为1×10-5, 1×10-6或1×10-7 mol/L. 每孔细胞数为1×104个. 设对照组（只加细胞不加试剂）和空白对照组（只加100 mL/L FBS RPMI 1640）. 每组设3个平行孔. 将培养板移入细胞培养箱孵育24,  48 或72 h. 取出培养板，每孔中加入MTT 20 μL后再次孵育4 h，弃上清液后每孔加入DMSO 150 μL. 高通道多功能微板测试系统中振荡5 min后在570 nm波长处检测A值. 重复实验3次. 另将细胞种于6孔培养板，于细胞培养箱中孵育4 h后取出，避光加入各种试剂及100 mL/L FBS RPMI 1640. 每孔液体总量为4 mL，试剂终浓度为1×10-5 mol/L，每孔细胞数为2×105个. 每次实验设1个对照组（只加细胞不加试剂）. 每组设2个平行孔. 再次将培养板移入细胞培养箱孵育，于24,  48 或72 h时收获细胞. -20℃  750 mL/L乙醇固定4℃过夜. PI染色缓冲液(50 g/L PI

和15 g/L Rnase) 避光室温孵育20 min，用流式细胞仪进行细胞周期分析. 重复实验3次.

　　统计学处理：  用SPSS 10.0统计学软件进行方差分析，结果以x±s 表示，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1细胞增殖MA无抑制A375细胞增殖的作用，而TTNPB在作用24和48 h时有抑制A375细胞增殖的作用，作用72 h时的高浓度时，也可抑制A375细胞增殖. 所有RA均有抑制A375细胞增殖的作用，但作用强度不同，atRA和13cisRA作用24和48 h有抑制A375细胞增殖的作用，但9cisRA仅在作用24 h的10-5 mol/L和10-6 mol/L浓度条件下有抑制A375细胞增殖的作用，并且其抑制作用弱于atRA和13cisRA处理组（P<0.05, Tab 1）. 表1各种RA对A375细胞的抑制作用（略）

　　2.2对细胞周期的影响MA不增加A375细胞G1/G0期细胞百分率，而TTNPB作用24和48 h时可增加G1/G0期细胞百分率. 3种RA在作用24 h时均可增加G1/G0期细胞百分率，作用48 h时9cisRA已经无此作用. 作用72 h所有试剂对G1/G0期细胞百分率均无明显的影响(Tab 2). 表2各种RA对A375细胞G1/G0期百分比的影响（略）

　　3讨论

　　RA是维生素A的代谢物或衍生物，对多种肿瘤细胞株有抑制增殖的作用［3-5］，其中包括恶性黑色素瘤细胞株［6,7］，但RAR及RXR在其中所起的作用尚不清楚. 本研究发现，3种RA和RAR激动剂TTNPB均可抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞的增殖，其中以TTNPB的抑制作用最强，而RXR激动剂MA则无此作用，说明RA具有抑制A375细胞增殖的作用，RXR的激活与RA抑制A375细胞增殖无关，而RAR的激活则可能与RA抑制A375细胞增殖有关. 细胞周期分析显示，RA和TTNPB具有诱导A375细胞G0/G1期阻滞的作用，其中以TTNPB的抑制作用最强，而MA无此作用，从而说明RXR的激活与RA诱导A375细胞G0/G1期阻滞无关，而RAR的激活则可能与这种作用有关. 实验结果显示，3种RA虽然都可抑制A375细胞增殖及诱导G0/G1期阻滞，但作用强度不同，以9cisRA的作用最弱. 这3种RA有着不同的受体结合特点，atRA是RAR和RXR的结合配体，13cisRA是RAR配体，9cisRA是RXR的配体，但它们为同型异构体，在细胞内可发生相互转换，所以尽管atRA和13cisRA为RAR的配体，但它们抑制A375细胞增殖和诱导G0/G1期阻滞的作用弱于TTNPB. 同样，尽管9cisRA为RXR的配体，但可通过互变异构活化RAR，从而具备一定的抑制A375细胞增殖和诱导G0/G1期阻滞作用. 

　　【】

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