HCV感染后肝硬化组织中整合素α3和αM的表达水平、部位及其意义

         作者：徐心，黎一鸣，吉鸿，候崇智，程颖波，赵晓鸽

【关键词】  整合素

    Localization and expression level of integrin subunits α3 and αM in human cirrhotic liver

　　【Abstract】 AIM: To investigate the value of integrin α3 and αM subunits as the markers of hepatic fibrosis in patients with hepatitis C virus (HCV) and post inflammatory liver cirrhosis by determining their localization and expression levels in the cirrhotic liver after HCV infection. METHODS:  With informed consent, 3 normal liver graft tissues and 12 liver tissues with post HCV inflammatory cirrhosis were obtained during operation. The cirrhotic liver tissues were divided into 2 groups: α3 and αM group, in which 8 patients were at Child A class, 2 at class B and 2 at class C. Immunohistochemistry was used to compare the expression levels and locations of α3 with those of αM. RESULTS:  No α3 and αM positive cells were found in normal liver tissues. The expression level of αM was higher than that of α3 significantly (P<0.05). In cirrhotic liver, the newlyformed basement membranes (BM) were associated with the positive expression of integrin α3 on the surfaces of the hepatocytes and sinusoidal epithelial cells (SECs). The integrin α3 was mainly located around the central vein and αM positive areas were distributed around central vein and portal area. No significant differences between Child classification A, B and C were found in α3 and αM expression. CONCLUSION:  Integrin α3 and αM subunits are involved in the development of capillarized sinusoids and play an important role in the initiation of liver cirrhosis. αM subunits can be used as a useful index in clinical tests.

　　【Keywords】 integrin; basement membrane; liver cirrhosis

　　【摘要】 目的：通过观测HCV感染后肝硬化组织中整合素α3β1亚单位和αMβ2亚单位表达水平和部位，研究其在肝硬化发生、中的分子标志意义. 方法：在知情同意的前提下，选择3例用于肝移植的正常供肝组织作为正常对照组，选择12例HCV感染后肝硬化门脉高压症患者，其中Child分级A级8例，B级2例，C级2例，术中取肝组织，分为α3和αM组，分别用免疫组化法检测肝组织中整合素α3，αM表达水平和部位，比较两者表达水平和部位的变化. 结果：正常肝组织中无整合素α3，αM表达. HCV感染后肝硬化，整合素αM阳性表达高于α3，差异有显著性（P<0.05）. α3阳性表达区域类似基底膜结构，位于肝细胞和窦状内皮细胞(sinusoidal epithelial cells，SEC)膜表面，主要分布于小叶中央静脉周围，αM阳性表达区域位于肝细胞和SEC膜表面和近膜胞质，分布于门管区和小叶中央静脉周围之间. 而且新生基底膜两侧的肝细胞和SEC细胞表面或近膜的胞质内都有明显的α3，αM阳性表达. 不同Child分级之间α3，αM表达无显著性差异（P>0.05）. 结论：整合素α3，αM与HCV感染后肝硬化肝窦毛细血管化形成过程有密切关系，αM可作为重要的检测指标.

　　【关键词】 整合素；基底膜；肝硬化

　　0引言

　　我们的研究主要针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染后肝硬化组织的临床病理特征，通过检测整合素α3β1亚单位和αMβ2亚单位表达水平及部位，初步讨论HCV导致肝纤维化和硬化发生的起始原因以及早期临床检测方法.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　分别选自西安大学第二普外科和第四军医大学西京医院肝胆外科200405/09住院患者. 正常组为3例肝移植供肝. 肝硬化组为12例HCV感染后肝硬化患者，实验室诊断（ALT，AST水平，抗HCV，Child肝功能分级指标）和术中取材大体标本及病诊断标准依据中华医学会联合修订《丙型肝炎防治指南》［1］. 取材：均在手术中相同部位取直径1 cm，厚0.5 cm的肝组织标本，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片.

　　1.2方法

　　各组标本石蜡切片分别按照α3和αM免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程公司)染色. 染色为棕黄色颗粒者为阳性细胞. 采用LEICA图像分析系统软件400倍视野阳性细胞分布面积比例和区域，-阴性;＋阳性表达面积<30％； 30％~50％；>50%.

　　统计学处理： α3和αM表达水平和部位数值比较应用Wilcoxon检验，P<0.05为差异有显著性.

　　2结果

　　2.1肝硬化程度判定12例肝硬化组患者均行临床Child肝功能分级，肝组织病理观察可见肝小叶形态不规则，小叶内肝细胞脂肪变性，Kupffer细胞、淋巴细胞聚集等HCV感染后肝硬化的特征性改变. 整合素α3和αM阳性表达判定方法参照Ouondamatteo等［2］的免疫组化研究结果.

　　2.2整合素α3和αM亚单位表达水平和部位特征正常肝组织中无整合素α3表达，肝硬化时阳性表达率为41.7％（5/12），可见肝细胞条索紊乱，小叶中央静脉周围可见部分肝细胞变性、坏死，纤维组织沉积，整合素α3亚单位表达阳性的细胞（Fig 1A）. 阳性表达部位主要位于小叶中央静脉周围肝细胞和肝窦内皮细胞膜表面. 同时肝血窦数目减少，血窦面积缩小，内皮细胞和肝细胞之间可以见到整合素α3亚单位高表达的阳性区域，形成层状基底膜样结构（Fig 1B）. 正常组织中无整合素αM亚单位表达. 肝硬化组织中表达阳性率为75％（9/12）. HCV感染后肝硬化组织整合素αM亚单位有较大的阳性表达，阳性面积>30％（Fig 2A）. 高倍镜下，可见阳性区域主要位于肝细胞膜和周围胞质（Fig 2B）.

　　2.3整合素α3和αM表达水平和部位差异如Tab 1所示，αM阳性表达水平高于α3，两者比较差异有显著性（P<0.05）. 而Child分级A，B和C组间比较差异无显著性. 根据肝腺泡（Liver acinus）理论，将肝小叶分为3个连续的区域，即Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ区. Ⅰ区为临近门管区的肝组织，Ⅱ区为小叶中央静脉周围肝组织，Ⅲ区为前两者之间肝组织. 如Tab 2所示，αM阳性表达区域多位于Ⅲ区，而αM阳性表达区域多位于Ⅱ区，但是因为免疫组化阳性面积图像分析对微观结构尚不能准确定量，所以两者部位比较差异无显著性.表1不同Child分级肝硬化组织中α3和αM的表达水平（略）表2不同Child分级肝硬化组织中α3和αM的表达部位（略）

　　3讨论

　　尽管我国肝硬化主要病因是乙型肝炎，HCV感染后肝硬化发生率占10%~20％，但是由于HCV感染隐匿，许多患者已经到肝功能失代偿时才得到确诊. 而且HCV导致肝硬化和肝细胞癌（HCC）发生率较高，其中肝硬化失代偿是HCV感染患者最重要的死亡原因. 所以找到HCV感染后肝硬化的起始事件，是HCV肝硬化、预防的关键.

　　肝窦毛细血管化是肝硬化发生的中心环节，新生的基底膜组织形成是其主要的表现. 细胞外基质（extracellular matrix， ECM）生成/降解平衡紊乱是肝窦毛细血管化的重要机制，而整合素是介导肝实质/非实质细胞与ECM之间信号转导、以及星状细胞（HSC，ECM的生成细胞）活化和相互作用的主要受体. 目前研究已经证实整合素参与了肝窦毛细血管化这一病理过程. Ouondamatteo等［2］发现整合素α3和α6亚单位在肝硬化肝细胞和窦状内皮细胞(sinusoidal epithelial cells, SEC)有较强的表达，与层黏连蛋白（Laminin, LN）表达部位相似. LN是基底膜主要的特异性结构成分，起着调控ECM形成的作用，其主要的细胞表面受体是肝细胞和SEC的整合素β1亚族α2，α3和α6亚单位，这些受体蛋白正常是无表达，肝硬化时LN受体表达上调，并进一步促进肝细胞和SEC产生多种黏附分子，参与ECM生成［3］.

　　我们的实验结果显示：HCV感染后肝硬化肝细胞和SEC表面就有很强的α3及αM亚单位表达. 在α3和αM阳性表达最高的区域，是缺氧、炎症损伤最重和纤维化明显的区域，可见kupffer细胞、淋巴细胞浸润，必将导致SEC和血小板激活. 研究证实激活的SEC和血小板释放多种细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNFβ1，TNFβ2）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等，通过旁分泌的作用使HSC激活、发生表型改变，活化的HSC（即肌成纤维细胞）还有自分泌TNFβ1和TNFα1的作用，进一步激活HSC［4］. 活化的HSC产生大量ECM，同时ECM降解酶系统相对或绝对不足，产生ECM生成/降解失衡，形成新生的基底膜. α3和αM是多种ECM成分，如LN,纤维连接蛋白（FN）的受体. 在肝硬化早期，LN和FN由整合素介导与细胞之间形成疏松的黏连，随着肝硬化的进展，胶原的沉积和成分改变，最终导致肝窦毛细血管化.

　　肝窦毛细血管化的形成，加上同时肝细胞微绒毛减少，SEC窗孔减少，孔径改变，胶原在内皮下沉积，Diss腔缩小，功能性血流量随之减少，物质交换功能障碍［5］. 此时肝脏物质/血流匹配严重失调，各项功能均受到损害. 所以整合素表达增加可能是肝纤维化或肝硬化的起始因素.

　　【】

　　［1］ 中华医学会肝病学分会，中华医学会传染病和寄生虫学会. 丙型肝炎的防治指南［J］. 中华内科杂志，2004；43：551-555.

　　Chinese Society of Liver Diseases, Chinese Society of Infectious  Diseases and Parasitology. Prevention and treatment of HCV［J］. Chin J Intern Med, 2004；43：551-555.

　　［2］ Quondamatteo F, Kempkensteffen C, Mlosge N, et al. Ultrastructural localization of integrin subunits α3 and α6 in capillarized sinusoids of the human cirrhotic liver［J］. Histol Histopathol, 2004; 19(3): 799-806.

　　［3］ Olaso E, Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrogenesis［J］. J Hepatol, 1998;29(5):836-847.

　　［4］ 高春芳，陆伦根. 纤维化疾病的基础和临床［M］. 上海：上海技术出版社，2004：278-280.

　　［5］ Xu B, Broome U, Uzunel M, et al. Capillarization of hepatic sinusoid by liver endothelial cellreactive autoantibodies in patients with cirrhosis and chronic hepatitis［J］. Am J Pathol, 2003;163(4):1275-1289.