LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备

         作者：李先茂，赵彤,朱梅刚,张三泉，张进华

【关键词】  聚合酶链反应

    Production of lentivirus of LMP1 and GFP recombinant gene

　　【Abstract】 AIM: To produce lentivirus of latentmembrane protein 1 (LMP1) and green fluorescent protein (GFP) recombinant gene. METHODS:  The fragment including all the exons of LMP1 was amplified by RTPCR and was recombined to the downstream of CMV promoter in the lentivirus vector FUGW. The three plasmids expressing lentivirus ［packaging plasmid pCMV.△8.9, envelope plasmid VSVG and target plasmid FUGWLMP1］ were packaged into virus packaging cell line 293FT using lipofectamine method. The virusproducing cell supernatant was harvested and concentrated. RESULTS:  It was proved that the sequence of the RTPCR product was totally consistent with the data of GenBank by DNA sequencing analysis. The LMP1 cDNA fragment was cloned in the vector FUGW in the right direction and the open reading fragment of LMP1 was maintained. The three plasmids were effectively transferred into 293FT. Much green fluorescence was observed by fluorescence microscopy. CONCLUSION:  The lentivirus of LMP1 and GFP recombinant gene are successfully produced.

　　【Keywords】 latent membrane protein 1; polymerase chain reaction; lentivirus

　　【摘要】 目的: 制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒. 方法: 采用RT PCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGW中. 经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体. 在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGWLMP1导入病毒包装细胞293FT， 荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，PCR鉴定. 结果： 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RTPCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合; LMP1准确克隆入FUGW的多克隆位点. 慢病毒的3种质粒可高效转染入293FT细胞，荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光. 绿色荧光位于细胞的胞膜及胞质. 结论: 成功制备了LMP1与GFP融合基因慢病毒，为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.

　　【关键词】 潜伏膜蛋白1;聚合酶链反应;慢病毒

　　0引言

　　EB病毒(EpsteinBarr virus,EBV)与淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症等多种疾病密切相关. 该EB病毒可编码至少60种产物,其中潜伏膜蛋白1 (latentmembrane protein 1, LMP1)具有广泛的细胞生物学功能［1］，在Ｂ淋巴细胞体外转化和永生化的过程中起重要作用; 经LMP1转化了的B淋巴细胞不仅在形态上发生了改变,而且具有使裸鼠致瘤的能力［2,3］. 如何将基因高效转染及长期稳定表达成为人们研究的热点. 近期研究者把目光投向了以Ⅰ型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1, HIV1)为代表的慢病毒不仅具有可感染非分裂期的细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点［4］，而且对重组包膜质粒、包装质粒及重组目的基因穿梭质粒进行了改造后，极大降低了其自我复制能力,使安全性大大提高，有望成为理想的基因载体［5］. 我们采用RTPCR方法获得LMP1全外显子片段,并将其克隆入慢病毒表达载体并进行了序列测定,利用包装细胞293FT制备了慢病毒，旨在制备LMP1与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合基因慢病毒，为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　质粒pCMV.△8.9, FUGW及VSVG由美国Carlos Lois博士惠赠，pCMV.△8.9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳结构； VSVG为包膜质粒;大肠杆菌JM109(本室冻存菌种); EBV感染绒猴Ｂ淋巴细胞株Ｂ95.8(本室冻存细胞株)一步法RTPCR试剂盒,购自Gibco公司;限制性内切酶BamHⅠ和Taq酶、T4 DNA连接酶、RNaseＡ, 琼脂(B.M.,宝灵曼);低熔点琼脂糖(FMC);dNTP, PCR marker, 普通琼脂糖、10 g/L EB(华美生物公司);胰蛋白胨和酵母提取物(Oxiod); Tris碱(Ｍｅｒｋ);其他试剂(均为国产分析纯).

　　1．2方法

　　1．2．1引物设计根据EBV基因组(Ｂ95.8来源)序列,设计合成了两条引物, 上游和下游引物分别对应于EBV基因组的169 474~169 456 bp与168 163~168 181 bp处,并且引入了限制性内切酶BamHⅠ的识别位点(上海生工生物工程公司合成).

　　1．2．2RTPCR法扩增LMP1 cDNA以下所用的常规方法参照［6］. 总RNA抽提用TRIzol试剂抽提Ｂ95.8细胞的总RNA,DNAseⅠ处理去除DNA污染. 琼脂糖凝胶电泳观察有无降解,测定其在λ260与λ280下的吸光度,吸光度比值和总RNA的含量. 逆转录反应：使用SUPERCRIPTTM ONE STEPＴＭ RTPCR system进行逆转录PCR. 反应体系为: 2 μL(约为2 μg)总RNA模板,2×反应液25 μＬ,下游引物(10 μmol/L) 1 μL, 2.5 mmol/L MgCl2溶液0.6 μL,酶混合物1 μL,最后用灭菌DEPC水补足至49 μL,50℃下,保温60 min. 加上游引物(10 μmol/Ｌ) 1 μL,在PCR热循环仪上进行以下反应: 94℃, 2 min; 94℃, 40 s→56℃, 1 min→72℃, 1 min 30 s,共35个循环; 72℃延伸8 min. 取5 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析.

　　1．2．3FUGWLMP1重组质粒的构建目的基因与FUGW质粒的酶切及纯化常规方法制备并纯化质粒. 目的基因和FUGW经BamHⅠ单酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的纯化片段. FUGW质粒纯化片段去磷酸化处理. 目的基因与FUGW的连接反应FUGW酶切纯化质粒1 μL(约0.1 μg), LMP1 cDNA酶切纯化产物5 μL(约0.4 μg),Ｔ4连接酶1 μL (1 Ｕ), 10×反应缓冲液1 μL,用水补足至10 μL, 16℃连接20 h. 重组质粒的转化：CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α. 将10 μL连接产物加入100 μL感受态菌中,冰浴30 min,42℃热休克90 s,立即静置冰浴2 min,加入800 μL LB培养基, 37℃ 100 r/min振摇45 min. 用无菌扩散棒将转化产物均匀涂布于含有100 mg/Ｌ氨苄的LB选择平板上倒置培养过夜.

　　1．2．4LMP1基因表达载体的限制性酶切鉴定及序列测定筛选数个阳性菌落,微量快速法提取质粒DNA,进行限制性酶切和PCR扩增. 委托上海博亚公司对重组载体进行序列测定,取与GenBank所公布的相应序列正向相符的质粒.

　　1．2．5慢病毒的包装、浓缩及鉴定按照操作说明，利用脂质体LipofectamineTM进行目的基因的转染. 在脂质体的介导下将上述质粒分两组（实验组、对照组）混合转染入293FT细胞，质粒为3种质粒混合，即包膜质粒（VSVG）、包装结构质粒（△8.9）、目的基因重组质粒（FUGWLMP1为实验组，FUGW为对照组），3种粒浓度混合比例（g/L）为5∶4∶3. 24~48 h后在荧光显微镜下观察，出现大量荧光后收集病毒上清，收集的病毒上清浓缩后分装备用或立即使用. 重组慢病毒活性测定: 将浓缩后的病毒贮存液作不同比例稀释，荧光分光光度计检测上清中病毒. 另外取500 μL加至293FT细胞培养瓶中，加入polybrene（聚凝安）终浓度为8 mg/L于37℃吸附30 min，换新鲜培养基继续培养18~24 h，于荧光显微镜下观察.

　　2结果

　　总RNA抽提用TRIzol试剂抽提的B95.8细胞总RNA的质量良好. A260 nm/A280 nm=1.8. LMP1 cDNA的RTPCR所设计引物位于LMP1全外显子的上下游,包含起始密码子,不包含终止密码子，扩增片段大小为1.1 kb. RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳见一清晰的特异性扩增条带,其大小与理论预期值相符. 基因慢病毒表达载体构建和鉴定：构建的基因表达载体经BamHⅠ单酶切,获得与目的基因一致的清晰条带,而空载质粒上只有9956 bp的单一片段（Fig 1）. 测序：DNA测序的结果表明，我们所获得的LMP1 cDNA与GenBank所公布的相应序列正向相符，无碱基缺失及错误. 慢病毒包装结果： 用质脂体将已构建的慢病毒载体系统中3种质粒成分转移至包装细胞293FT中,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实已有大量质粒转染入293FT细胞，绿色荧光位于细胞的胞膜及胞质（Fig 2,3）这与LMP1的表达位置一致. 荧光分光光度计检测病毒上清 ,设激发波长为470 nm,测到510 nm处激发出荧光; 取病毒上清感染293FT，荧光显微镜下观察细胞膜上及胞质中有绿色荧光分布，说明制备的慢病毒有活性.

　　3讨论

　　我们选用复制HIV1作为载体，制备了EB病毒LMP1与荧光蛋白融合基因慢病毒. 复制缺陷型HIV1载体由目的基因载体成分、包装结构成分和包膜结构成分三部分组成. 目的基因载体成分是将HIV 3′端LTR中的U3部分切短，使之丧失启动病毒复制功能，同时插入CMV启动子的调控，即成为复制缺陷型病毒载体. 包装结构成分由HIV1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，但能够提供产生病毒颗粒所必须的蛋白，如gag和pol蛋白，极大降低了其自我复制能力,使安全性大大提高. 为了便于观察研究,本研究中采用新型报告基因绿色荧光蛋白(GFP)基因,将其与LMP1基因共同构建至载体上.

　　GFP作为报告基因的特点和优势在于: GFP在470 nm波长处可吸收激发光,在510 nm发射绿色荧光, 只要有足够的表达,在紫外光照射下,无需引入别的物质,在活体内通过显微镜就能清晰地观察到. 而其他一些报告基因如氯霉素、乙酰转移酶Ⅱ［7］、β半乳糖苷酶、荧光素酶等都需要用底物、辅助因子等参与才能检测其活性. 因此, GFP作为报告基因具有观察简单方便和直观的优点［8］. 本研究在质粒转染后,通过荧光显微镜观察到细胞膜上及胞质中有大量绿色荧光,说明已有大量质粒转染入293FT细胞;进一步收集病毒上清,初步证实了慢病毒包装成功,存在于病毒上清中，为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.

　　【】

　　［1］ Panagopoulos D, Victoratos P, Alexiou M, et al. Comparative analysis of signal transduction by CD40 and the EpsteinBarr virus oncoprotein LMP1 in vivo［J］. J Virol, 2004;78(23):13253-13261.

　　［2］ Li W, Wu BA, Zeng YM, et al. EpsteinBarr virus in hepatocellular carcinogenesis［J］. World J Gastroenterol, 2004;10(23):3409-3413.

　　［3］ Cherney BW, Sgadari C, Kanegane C, et al. Expression of the EpsteinBarr virus protein LMP1 mediates tumor regression in vivo［J］. Blood, 1998;91(7):2491.

　　［4］ Ouyang J, Alway SE. Transgene expression in hypertrophied and aged skeletal muscle in vivo by lentivirus delivery［J］. J Gene Med, 2004;6(3): 278-287.

　　［5］ Lois C, Hong EJ, Pease S, et al. Germline transmission and tissuespecific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors［J］. Science, 2002;295(5556):868-872.

　　［6］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆实验指南［M］. 第3版. 黄培觉译. 北京：出版社，2002： 516-540.

　　［7］ 郭军,丁杰,樊代明,等. 小鼠α1,3半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建［J］. 第四军医大学学报, 2003;24(1)：37-39.

　Guo J, Ding J, Fan DM, et al. Cloning of the murineα1,3galactosyltransferase and construction of its recombinant eukaryotic expression［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(1):37-39.

　　［8］ 欧阳为明,张继帅,金伯泉，等. pCDM8GFP报告载体的构建及鉴定［J］. 第四军医大学学报, 2003；24（2）:131-132.