生长激素对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜屏障功能损害的保护作用

【关键词】  重组人生长激素；胆汁淤积；黏膜屏障；免疫屏障

   【Abstract】 AIM: To probe into the protective influence on the mechanical and immune barriers exerted by recombinant human growth hormone (rhGH) at ileum in rats with obstructive jaundice. METHODS: In common bile duct (CBD)ligated Wistar rats, morphological changes in ileac mucous membrane, sIgA variation in ileac juice and altered bacterial translocation were observed and compared before and after rhGH administration. RESULTS: CBDligated rats had thinner ileac mucous membrane ［(232±22) μm vs (362±43) μm］ and shorter villi ［(158±22) μm vs (254±39) μm］. Meanwhile, sIgA concentration in ileac juice dropped ［(70±14) mg/L vs (162±32) mg/L］ and bacterial translocation rate increased (3/12 vs 0/15). After using rhGH administration for 1 week, the ileac mucous membrane of CBDligated rats get thicker ［(308±34) μm vs (232±22) μm］ and the villi get longer ［(216±29) μm vs (232±22) μm］ and stronger. Microstructure of ileac membrane get comparatively normalized. sIgA  level in ileac juice rose ［(114±18) mg/L vs (70±14) mg/L］. Rate of bacterial translocation decreased (2/15 vs 3/12). CONCLUSION: Rats with obstructive jaundice suffer from morphological and immune abnormalities in ileac membrane. rhGH administration can correct these abnormalities and afford a good protection on impaired mucosal and immune barriers in rats with obstructive jaundice.

   【Keywords】 recombined human growth hormone; cholestasis; ileac mucosal barrier; immune barrier

   【摘要】 目的：探讨重组人生长激素(rhGH)对梗阻性黄疸大鼠肠道机械屏障和免疫屏障的保护作用. 方法：结扎大白鼠胆总管并应用rhGH，观察其回肠黏膜形态学、回肠液sIgA改变及肠道细菌移位情况. 结果：梗阻性黄疸时，大鼠回肠壁呈现肌层变薄，黏膜厚度减少［(232±22) μm vs (362±43) μm］，肠绒毛变短［(158±22) μm  vs (254±39) μm］,变细或绒毛融合等形态学改变；回肠液中sIgA浓度减少［(70±14) mg/L vs (162±32) mg/L］及细菌移位例数增加(3/12 vs 0/15). 应用外源性生长激素1 wk后，回肠黏膜厚度增加［(308±34) μm vs (232±22) μm］，肠绒毛增粗、增长［(216±29) μm vs (232±22) μm］，结构保持相对完整，回肠液中sIgA浓度回升［(114±18) mg/L vs (70±14) mg/L］，细菌移位减少(2/15 vs 3/12). 结论：梗阻性黄疸时，大鼠肠道的机械和免疫屏障功能受损，给予外源性rhGH可以较好地保护受损的肠道机械和免疫屏障功能.

   【关键词】 重组人生长激素；胆汁淤积；黏膜屏障；免疫屏障

    0引言

   梗阻性黄疸可导致机体多种复杂而严重的病理生理改变. 因肠黏膜屏障功能减退，肠道局部免疫功能下降而引起的内毒素血症、肠道细菌移位，是导致患者病情恶化甚至死亡的重要因素. 因此，探讨梗阻性黄疸时肠黏膜形态及功能受损的机制，研究生长激素可能对这些病理情况的保护作用有着重要的临床意义. 我们通过梗阻性黄疸大鼠模型，探讨梗阻性黄疸时，肠道机械屏障和免疫屏障损伤的发生机制，以及重组人生长激素(rhGH)对它们的影响.

   1材料和方法

   1.1材料Wistar大鼠60只，雌雄不拘. 由郑州大学医学部实验动物中心提供，体质量200~250 g. 125IsIgA药盒由北京原子高科核技术应用股份有限公司提供；rhGH制剂由长春金赛公司生产；全自动生化分析仪等设备由河南科技大学医学院外科实验室及河南科技大学第一附属生化室等机构提供.

   1.2方法将实验大鼠随机分为4组，每组15只，分别是假手术组(A组)、胆总管结扎组(B组)、胆总管结扎+rhGH1 wk组(C组)和胆总管结扎+rhGH治疗2 wk组(D组). 实验大鼠均禁食12 h后，以5 g/L硫贲妥钠1.0~1.5 mL腹腔注射麻醉，经上腹部正中切口入腔，游离胆总管. A组不结扎胆总管，其余各组则将游离后的胆总管在两个不同的部位分别用细丝线结扎，致胆道完全梗阻，再分别缝合腹壁肌层和皮肤.

   所有动物在手术前后均为自由饲养. A, B组，均于术后2 wk时处死大鼠取标本. C,D组则于术后次日开始，交替双后肢皮下注射rhGH 0.75 U/kg，1次/d，C组于1 wk后处死，D组2 wk后处死. 所有实验大鼠，取材时均先肉眼观察肝胆系统及肠系膜淋巴结大小等病变情况；取腹水及无菌匀浆后的肠系膜淋巴结，接种做细菌培养；最后收集长约10 cm的末段回肠内的消化液及用2 mL生理盐水冲洗肠腔后的冲洗液，以4000 r/min离心10 min，取上清液，-20℃下保存，行sIgA测定. 将上述回肠组织以750 mL/L乙醇固定，石蜡包埋切片，HE染色，用多媒体彩色病理图文分析系统，测量回肠黏膜厚度和绒毛高度.

   统计学处理：采用SPSS 12.0软件进行数据处理，所用统计分析方法用χ2检验、方差分析和LSDt检验.

   2结果

   2.1大鼠一般情况观察胆总管结扎2~3 d后，大鼠耳尖及尾部皮肤开始变黄，尿液变黄；4～6 d后黄疸明显，鼠粪颜色变灰白，活动减少. A组无死亡，B组于术后3，10，12 d各死亡1只，C组无死亡，D组于术后7 d死亡1只.

   2.2肠系膜淋巴结肉眼观察与对照组相比，梗阻性黄疸大鼠(B组)腹腔内脏浆膜面黄染，肠系膜根部淋巴结串珠状肿大，无脓苔. 应用rhGH 1 wk(C组)或2 wk(D组)后，肠系膜淋巴结无肉眼可见的变化.

   2.3腹水与肠系膜淋巴结细菌培养大鼠腹水中能够检测到细菌的例数分别是A组0/15例，B组3/12例，C组2/15例，D组1/14例. 大鼠肠系膜淋巴结中能够检测到细菌的例数分别是A组0/15例，B组5/12例，C组3/15例，D组2/14例. 纵观两组细菌培养结果，B组与A组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；C，D组与B组相比，差异有统计学意义(P<0.05). C，D两组相比，差异无统计学意义(P>0.05).

   2.4回肠液中sIgA浓度变化梗阻性黄疸大鼠回肠液中的sIgA浓度A组为（162±32）mg/L，B组为（70±14）mg/L，C组为（114±18）mg/L和D组为（126±17）mg/L. B，C，D组sIgA明显低于A组(P<0.01)；C，D组sIgA明显高于B组（P<0.05）；C，D两组之间差异无统计学意义(P>0.05).

   2.5回肠黏膜光镜下组织学观察见图1,2.

   2.6大鼠回肠黏膜厚度与绒毛高度与对照组相比，梗阻性黄疸大鼠组(B组) 绒毛高度和黏膜厚度值明显降低. 梗阻性黄疸大鼠组(B组)给予rhGH 1 wk（C组）或2  wk（D组）后，绒毛高度和黏膜厚度值则又明显升高(表1).表1梗阻性黄疸大鼠回肠黏膜厚度及绒毛高度

   3讨论

   正常情况下，肠道内存在的大量细菌不能够进入人体组织或血循环，依赖于肠道对细菌具有的机械、生物、化学和免疫屏障. 当各种原因导致肠道的机械屏障受到破坏后，内毒素分子先行进入血循环，引起内毒素血症，再由肠内细菌向肠外组织迁移，进入肠淋巴结、血液或肝、脾，形成细菌移位.

   通过本实验可以看出，当大鼠梗阻性黄疸时，回肠壁肌层变薄，黏膜厚度和绒毛高度降低. 正是由于梗阻性黄疸大鼠小肠黏膜结构形态学上的改变导致了机械屏障的不完整. 在梗阻性黄疸状态下，肠系膜血流减少, 以及缺血再灌注损伤［1］,导致消化道黏膜的病理改变. 另有研究显示，还可发生末段回肠黏膜超微结构的明显异常，凋亡现象增多［2-3］；CD44 mRNA在肠道上皮细胞的表达受到抑制［4］，它作为细胞之间以及细胞与间质之间的黏附因子，对于保持肠道绒毛的完整性至关重要；加之梗阻性黄疸时肝脏的蛋白合成功能下降，胃肠道黏膜上皮更新、再生所需的蛋白质供应不足，进一步影响了肠道黏膜上皮的再生和修复，最终肠道的机械屏障受到破坏，从而发生细菌移位.

   梗阻性黄疸时，发生细菌移位的另一原因是肠道局部免疫功能下降. 本研究证实，与对照组相比，梗阻性黄疸大鼠回肠内sIgA浓度明显下降. 在梗阻性黄疸时，因胆盐不能进入肠道，影响T淋巴细胞分化成熟，进而使肠道黏膜固有层的CD4，CD8细胞减少［5-7］，浆细胞分泌sIgA减少，同时肝胆系分泌型IgA随胆汁返流入血，使肠道内sIgA水平进一步降低. 另外，在梗阻性黄疸时，肝脏网状内皮系统对于进入血循环的细菌和抗原的吞噬和杀灭作用功能的减退［7］，以及梗阻性黄疸时，因胆汁不能进入肠腔，该化学屏障功能丧失或减弱，共同导致细菌移位.

   动物和临床研究证实，给予一定量的谷氨酰胺和精氨酸等免疫营养物质，可以改善肠道的机械屏障功能和肠道免疫屏障功能［8-9］. 胆汁回流入肠道也有助于改善梗阻性黄疸患者的肠黏膜机械屏障［10］，从而防止肠道细菌移位.

   rhGH在梗阻性黄疸时，应用于改善肠道屏障功能及局部免疫功能的研究则很少. 从本实验结果可以看出，使用外源性的rhGH 1 wk后，梗阻性黄疸大鼠的回肠壁肌层变厚，浆膜面完整，黏膜厚度增加，肠绒毛高度增加，排列整齐，结构相对完整，说明梗阻性黄疸大鼠的肠道机械屏障得以较好地改善；同时，肠道内的sIgA浓度由B组的（70±14）mg/L升至C组的（114±18）mg/L和D组的（126±17）mg/L，均P<0.01. 说明rhGH可以通过恢复损害的肠黏膜上皮细胞的完整性，以及通过增加回肠上皮细胞对sIgA的合成和分泌，很好地保护梗阻性黄疸大鼠受损的肠道机械屏障和免疫屏障功能，从而减少细菌移位. 其产生保护作用的机制可能是：①通过与肝细胞膜上的受体结合，促进肝脏合成胰岛素样生长因子I(IGFI)，促进肠上皮组织细胞的分化、成熟与损伤修复； ②能上调GHIGFI轴活性，可增强白细胞的吞噬等细胞免疫功能［11］，同时，促进T淋巴细胞的分化和成熟，肠道局部产生sIgA增多，增强体液免疫功能. ③能明显改善因胆道阻塞引起的胆管增生和胆管周围纤维化［12］，促进肝门周围肝细胞再生，增加蛋白合成. ④通过肠道黏膜上广泛存在的rhGH受体，增加内源性谷氨酰胺(GLN)的合成及摄取和利用［13］，从而促进肠黏膜DNA含量［3］的增长，维持良好的屏障作用. 从实验结果还可以看出，使用外源性的rhGH 2 wk与使用rhGH 1 wk相比，对改善肠道局部免疫指标sIgA、对肠黏膜形态的改善作用和肠道细菌移位率的影响均无统计学意义，这对临床上使用rhGH的时间将提供重要的依据.

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