I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生

        作者：钱济先 ，张柏根 ，李桂云 ，张岚，邓廉夫，朱雅萍

【关键词】  内皮素

　　关键词: 内皮素;反义寡核苷酸;血管平滑肌细胞

　　摘 要:目的  观察Ⅰ型内皮素受体（ETA）反义寡核苷酸（ODN）对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和内膜增生的抑制作用. 方法  ①细胞培养:取家兔主动脉中膜消化后培养传代，经抗α-actin鉴定后使用第4～6代传代细胞;②人工合成ODN:经Genbank检索筛选，合成含18bp ETA-ODN片段，再对5'端硫代修饰以增加稳定性，同时行地高辛标记以检测反义片段的细胞膜穿透性;③MTT分光光度法检测ETA-ODN对VSMC增殖的抑制作用;④运用放射受体结合分析法（125 I-ET-1）了解ODN对ETA蛋白表达的抑制作用，以探讨其反义作用;⑤兔颈动脉空气干燥模型在体研究ODN对血管内膜增生的抑制作用:应用F-127凝胶载体携带ETA-ODN（3.0μmol L-1 ）导入血管周围，术后不同时间观察增生内膜相对厚度. 结果  ODN于培养后12h进入细胞内，并逐渐增加;15μmol L-1 ETA-ODN对VSMC增殖具有抑制作用，24h后即有显著作用;ETA-ODN对ETA表达亦有明显的抑制作用，表现为CPM于24h逐渐减少;ETA-ODN导入后，血管增生内膜相对厚度减少. 结论  ETA-ODN以浓度和时间依赖方式抑制ETA蛋白表达以及VSMC的增殖;反义寡核苷酸是通过反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用.
    
　　Antisense endothelin┐1receptor oligonucleotide in┐hibit vascular smooth muscle cell proliferation and intimal hyperplasia
         
　　Abstract:AIM To evaluate the inhibitive effect of antisense endothelin-1receptor oligonucleotide（ODN）on VSMC growth and intimal hyperplasia.METHODS ①Cell cul-ture.The medium of rabbit aorta were harvested，digested and the dispersions were cultured.The cells of passage4～6were routinely used to study after identification withα-actin antibody.②ODN synthesis.The antisense sequences were designed and screened through Genebank scanning.After these procedures，eighteen phosphorothioate antisense com-plementary to ETA cDNA were synthesized，and eventually labeled with digoxin by which the sequences stability be aug-mented and membranous permeability tested.③MTT method was used to evaluate DNA synthesis in ODN treated VSMC.④125 I-ET-1radiobinding assay to ETA and immuno-histochemistry were utilized to examine protein expression of the receptor，and to discuss roles of the ODN.⑤ODN dis-solved in200mL L-1 F-127gel solution at concentration of3.0μmol L-1 were applied to surround the exposed region of carotid artery on the basis of Air Dry Model.Thus the inti-mal thickness and luminal narrowness could be investigated.RESULTS ①ETA-ODN could be found in cultured VSMC in12h and gradually increased.②ETA-ODN at concentra-tion of15μmol L-1 suppressed VSMC proliferation，which showed a significant action in24h.③ETA protein expres-sion was reduced，indicated by the phenomenas that CPM progressively decreased in24h.④Intimal thickness and lu-minal narrowness were lightened after ETA-ODN induction.CONCLUSION ETA-ODN suppresses ETA expression and SMC proliferation in a time and concentration dependent manner.ETA plays an important role in mediating cultured VSMC proliferation course.ETA-ODN exerts inhibitory function through antisense mechanism.

　　0 引言

　　血管移植或动脉腔内成形术后血管内膜均不同程度地发生增生，严重的可致血管狭窄或再狭窄.内膜增生的细胞学基础是血管中膜平滑肌细胞（SMC）向内膜迁移并增殖，因此若能控制血管SMC（VSMC）增殖即可实现抑制内膜增生.既往人们用化学药物，如阿斯匹林、潘生汀、肝素和类皮质激素等试图抑制血管内膜增生［1］ ，但效果均不理想.近年来的研究证明I型内皮素（ET-1）在诱导血管收缩和VSMC增殖方面起重要作用，在动脉粥样硬化的VSMC中，Ⅰ型内皮素受体（ETA）mRNA表达显著增多［2］ ，而且ET-1可增加VSMC内 3 H-TdR结合率［3］ ，增强PDGF诱导的DNA合成［4］ .现已明确，ET在血管内膜增生中发挥着重要的促分裂效应.作为基因的一方面，反义技术已逐渐成为血管领域的重要的治疗方法［5］ .针对ET-1及其受体ETA在血管SMC增殖和内膜增生中的重要作用，我们合成了含18bp的ETA反义寡聚核苷酸（ODN），并经硫代膦酸修饰，在离体SMC培养和动物在体模型基础上探讨ODNS对VSMC上ETA蛋白表达、SMC增殖和内膜增生的影响，为防治血管内膜增生和血管狭窄提供实验依据.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 细胞培养 

　　无菌取家兔主动脉段，去内外膜置100mL L-1 NBS DMEM培养液中，剪碎，吸去DMEM，加1.25g L
     -1 胰蛋白酶震荡消化45min，低速离心（1000r min-1 ），弃组织块，收集上清液加培养液移至培养瓶（75mL），置37℃，50mL L-1 CO2 孵箱.取用第4～6代细胞，多余细胞分装冻存备用.

　　1.2 SMC鉴定 

　　将SMC按每孔1×10 4 个细胞转种于置有无菌载玻片的6孔板内，37℃，50mL L-1 CO2 孵箱内培养，细胞贴壁生长至一定密度时取出载玻片，免疫组化（ABC）染色后观察.
    
　　1.3 反义核苷酸的设计合成 

　　根据已克隆的大鼠ETA核酸序列［6］ ，经中科院上海生化所Genebank检索后，分别筛选并设计特异性高的含18bp的反义片段，DNA合成仪合成30A的寡核苷酸.同法合成相应的正义片段.另外合成标有地高辛的反义ETA10A，以验证反义核酸的膜穿透性.5'端碱基硫代磷酸化修饰以增加寡核苷酸在血清中的稳定性.
    
　　1.4 ODN的膜透性检测 

　　将地高辛修饰标记的ETA ODN（10μmol）与SMC共培养，爬片生长，孵箱培养4，12，24和48h后取出玻片，通过抗体免疫 组化呈色反应以显示ODN的细胞膜透性.每种因素重复3次.
    
　　1.5 ETA┐ODN对血管SMC增殖的作用 MTT实验 

　　取第四代细胞接种96孔板，密度每孔1×104 细胞，孵育48h，分别加入ETA-ODN5.0，10.0和15.0μmol L-1 ，设立正义对照、阴性对照（不加ODN）和空白对照（不加细胞），每组3孔，培养12，24，48和72h后分别加入质量分数为50mg L-1 的MTT，孵育4h后再加入二甲基亚砜20μL，移至酶标仪测定光度值. 1.6 细胞生长计数  根据上述结果，用15μmol L-1 浓度的ETA-ODN观察对SMC生长的抑制作用.按1×104 密度接种24孔板，时间组和其他步骤同上，在倒置显微镜下活细胞个数.
    
　　1.7 ETA┐ODN对ETA蛋白表达作用

　　放射受体结合分析法  将经ETA-ODN（15μmol L-1 ）处理过的细胞制成悬浮液，加入125 I-ET-1250μL（摩尔活度63GBq mol-1 ），37℃孵育2h，离心弃上清，用冷DMEM快速洗3遍，进行γ计数.以加入10-7 mol L-1 未标记的ET-1200μL后（不加为空白对照）所得的每分计数（cpm）作为非特异性结合率，样品的cpm减去非特异性结合的cpm为125 I-ET-1的特异性结合率.
    
　　1.8 ETA┐ODN对血管内膜增生的作用的在体实验

　　1.8.1 血管模型的建立和反义寡核苷酸的导入 

　　30mL L-1 戊巴比妥钠（40mg kg-1 ）静脉麻醉，家兔取仰卧位消毒后，沿颈正中切开皮肤，显露颈动脉，轻柔剥离外膜后游离颈动脉2.0cm长，上下无创夹阻血后，从一端注入空气，另一端抽出空气，持续10min（Fig1），造成血管内皮细胞脱落.在血管周围注入4℃预冷、混有ETA-ODN的200mL L-1 F-127多聚凝胶500μL，寡核苷酸的浓度为3.0μmol L-1 .F-127在37℃时呈固态凝胶，待其由液态变为固态后缝合皮肤.

　　1.8.2 动物分组 

　　健康成年家兔24只，体质量（3.1±0.5）kg，雌雄不拘，随机分为3组，每组2只（4条动脉）.一组为ODN处理组，其他两组为阴性对照组（加F-127不加反义）和空白对照组（不加反义和F-127），术后48h，1，2和4wk不同时间取材.取材时注意使血管不扭曲，保持合适张力.
    
　　1.8.3 微机图像分析 

　　标本切片图像经显微摄像机摄入图像分析系统后，计算血管增生内膜的厚度.其中内膜厚度以增生内膜厚度与中膜和内膜联合厚度的相对值表示，每组围绕管腔测10次，取平均值计算.
   
　　统计学处理:组间采用团体t检验（STATPAL软件包）.

　　2 结果
    
　　2.1 细胞培养及鉴定

　　VSMC经传代培养后，细胞形态稳定，抗α-actin抗体免疫组化阳性，证实培养的细胞为VSMC.
    
　　2.2 ODN纯度及膜透性检测 

　　通过抗体免疫组化呈色反应结果:4h阴性，12h弱阳性，24和48h阳性（Fig2）.说明ETA ODN能在12h进入细胞内，并在24和48h逐渐增多.
   
    2.3 ETR┐ODN对血管SMC增殖的作用 

　　MTT光度值结果如Tab1.从表中所知，15μmol L-1 的ETA-ODN24h与阴性对照组有显著性差异（P=0.0343），48h与阴性对照组也有显著性差异（P=0.0303）;以培养后时间组比较，15μmol L-1 ETA-ODN12与48h差异显著（P=0.0418），12与72h也有显著性差异（P=0.0385），说明15μmol L -1 ETA-ODN对SMC增殖具有明显的抑制作用.正义对照组与阴性对照组相近，说明正义寡核苷酸无效.表1 加入ETA-ODN后VSMC的光吸度值（略）
 
　　2.4 细胞生长计数结果 

　　上述结果可见15μmol L-1 ETA-ODN具有明显抑制SMC增殖的作用，因此用上述浓度的ETA-ODN观察对SMC生长的抑制作用，表明有明显抑制VSMC生长的作用 （Tab2）.表2 加入ETA-ODN后VSMC生长密度（略）

　　2.5 ODN对ETA蛋白表达的抑制作用 

　　通过125 I-ET-1（50μL）放射受体结合分析实验，经Gamma计数显示15μmol L-1 的ETA-ODN具有明显抑制ETA的表达（Tab3）.随培养时间的延长，ETA-ODN处理后cpm逐渐减少，到48h即有显著性差异;与对照组相比，24h即有显著性差异，说明ETA-ODN（15μmol L-1 ）明显抑制ETA表达.表3 加入ETA-ODN后VSMC（略）
    
    2.6 ETA┐ODN对血管内膜增生的抑制作用 

　　经反义基因导入后，结果显示ETA-ODN不仅减缓内膜增生的，而且对内膜增生具有明显的抑制作用（Tab4）. 表4 血管内膜相对厚度
   
　　3 讨论
    
　　VSMC增殖和内膜增生是血管移植术、血管成形术后狭窄或再狭窄的主要原因［7］ .当VSMC受外界因素刺激后，细胞内部通过一系列信号传导系统作用，启动细胞内调节细胞增殖的基因表达，最终导致细胞增殖.其中，血管活性因子在促进细胞增殖过程中起着重要作用.ET-1作为VSMC分裂增殖的强效生物活性物质在诱导狭窄和再狭窄发生机制中占有重要地位［8］ .过去研究已经证明，VSMC上ETA的表达与内膜增生存在正相关效应［9］ ，ET-1藉与ETA结合后触发的促分裂可能在内膜增生过程中发挥重要作用［10］ .以前人们试图应用化学药物抑制VSMC增殖和内膜增生，但效果不理想，而且作用不特异.体外合成的反义寡核苷酸可特异与某些基因的DNA或mRNA结合，以阻止该基因的转录或翻译，达到削弱该基因的目的.本研究就是应用ETA反义寡核苷酸特异抑制ETA蛋白的表达，从而减弱ET-1促增殖效应.ET-1能显著增加细胞内3 H-TdR结合率，增强PDGF诱导的DNA合成，有人用3 H-TdR结合率来反映细胞的增殖状态［11］ .四唑蓝比色试验法（MTT）是检测细胞生长和存活的方法，它与细胞计数、软琼脂克隆试验和 3 H-TdR掺入试验有良好的相关性，而且灵敏度高，重复性好，操作简便、、快速、易自动化，因此本实验采用MTT法检测细胞增殖情况.本研究经预实验摸索并结合［12］ 报道，发现15μmol L -1 浓度的ETA对培养的血管SMC具有抑制作用，并通过膜透性检测证实ETA-ODN能于培养后24h进入细胞内且发挥作用，说明ETA-ODN以浓度和时间依赖方式抑制SMC增殖，细胞生长计数也显示有良好的相关性.实验还同时说明在本实验条件下ETA参与了VSMC的增殖过程，这与国外一些作者的实验结果相佐［13］ .对细胞内相关基因蛋白水平的检测，能了解该基因在细胞功能活动中的活跃程度.由于目前无市售ETA抗体，本实验采用放射受体结合分析法间接了解ETA蛋白表达 情况，结果发现ETA-ODN作用24h后即有明显的抑制ETA表达的作用，说明ETA-ODN是通过反义途径实现对ETA的抑制.在体空气干燥模型与球囊导管模型有同样效率［14］ ，均可造成血管内皮细胞的脱落，继而诱发内膜增生.但空气干燥模型操作简便快捷，损伤均匀，效果确切.F-127是一种具有特定物理性质的多聚凝胶，在4℃时表现为液态，37℃时聚合成凝胶状，利用这一特性，将一定浓度的寡核苷酸混合其中，转到动物体内后，由于温度上升，可迅速变为固态，使寡核苷酸较长期而缓慢地释放在血管周围，避免了短时间内大量寡核苷酸进入体内的副作用［15］ .本结果显示ETA-ODN（3.0μmol L-1 ）能减少增生内膜的厚度和管腔的狭窄，说明在体情况下ETA-ODN同样具有抑制SMC增殖的作用.应用F-127可达到局部定点高浓度缓释寡核苷酸的作用，有效地提高了局部效应，但对载体的稳定性和反义寡核苷酸的毒性还需作进一步研究.
   
　　综上所述，ETA-ODN以浓度和时间依赖性方式抑制ETA蛋白表达以及VSMC的增殖;反义寡核苷酸是通过反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用;在抑制血管内膜增生和VSMC增殖方面ETA-ODN显示出良好的临床应用前景.

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