肝癌细胞系MHCC97亚群中甲胎蛋白的表达差异

          作者：张宁，窦科峰，李韧，樊菁，张福琴

【关键词】  ,肝细胞癌；甲胎蛋白；边缘群；异质性

   【Abstract】 AIM: To explore the expression characteristics of alphafetoprotein (AFP) in different subpopulations of MHCC97 cell lines of human hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: Side population (SP) cells and nonSP cells were telled using FACS analysis according to the ability of these cells to extrude the Hoechst 33342 dye. Immunocytochemical staining was performed to show the expression of AFP in SP and nonSP cells. RESULTS: With the Hoechst 33342 extrusion assay, SP cells were found to account for 1.8% of the MHCC97 cells， and AFP was much more expressed in SP cells than in nonSP cells. CONCLUSION: The differential expression of AFP can be seen in MHCC97 cell lines，and most AFP positive cells are from SP cells, indicating HCC is heterogeneous.

   【Keywords】 hepatocellular carcinoma；alphafetoprotein； side population；heterogeneity

   【摘要】 目的：探讨甲胎蛋白（AFP）在不同肝癌细胞亚群中的表达差异. 方法：应用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞分成边缘群（SP）及非边缘群(NonSP) 2个细胞亚群，采用免疫细胞化学方法观察AFP在2个不同肝癌亚群中的表达变化及含量. 结果：SP细胞仅占细胞总体的1.8%，SP细胞AFP表达明显高于NonSP细胞（P<0.01）. 结论：AFP在肝癌细胞中表达有差异，强阳性多数分布在SP细胞亚群中，进一步证实了肿瘤的异质性.

   【关键词】 肝细胞癌；甲胎蛋白；边缘群；异质性

     0引言

   病很早就证实，AFP在肝癌组织中的表达具有显著的异质性（heterogeneity），但对AFP这种异质性的分布及意义存在较大的争议. AFP在肝癌组织中的差异表达有可能反映了肝癌组织中不同癌细胞在分化程度上的差异. 近年来，利用流式细胞荧光激活分选法可以获得组织中具有原始干细胞特征的成体细胞［1-2］，利用类似的方法可以将肝癌细胞分成两个不同特征的亚群［3］，因此，探讨AFP在这两个不同亚群肝癌细胞中的表达差异对阐明和验证肝癌组织中是否存在具有干细胞特征的肿瘤细胞具有重要的意义.

   1材料和方法

   1.1材料MHCC97细胞系(人高转移肝癌细胞系)购自上海复旦大学中山肝癌研究所. 免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒（中杉金桥）、FACS Advantage II型六色荧光流式细胞仪（美国BD公司）、BX51免疫荧光显微镜及DP70数字图像摄影系统（Olympus公司）.

   1.2方法

   1.2.1边缘群(SP)细胞及非边缘群(NonSP)细胞的检测①细胞染色：MHCC97细胞常规消化，HBSS洗涤，制备成单细胞悬液，细胞密度为1×109/L. 等分细胞悬液，两组均加入荧光染料Hoechst 33342使终浓度为6 mg/L，其中一组再加入维拉帕米，终浓度50 mmol/L. 37℃避光水浴90 min，冰上10 min终止染色，冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬浮. 再加入PI使终浓度为2 mg/L. ②流式细胞仪检测：355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst red为X轴，Hoechst blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst red及低Hoechst blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），百分比. 分选出SP细胞及NonSP细胞.

   1.2.2AFP免疫细胞化学分析将SP细胞及NonSP细胞分别接种于盖玻片，50 mL/L CO2孵箱37℃ 4 h，40 g/L多聚甲醛常规固定. 免疫细胞化学采用SP法，操作步骤参照试剂盒说明书. AFP单抗最适工作浓度1∶100，DAB显色，胞质见棕黄色颗粒为阳性，PBS代替一抗作为阴性对照. 在20倍光镜视野下各选取3个细胞最为密集的区域，应用ProPlus软件分析各组细胞的A值，将A值划分等级并分别计数，<0.18为“-”，0.18～0.5为“+”，0.5～1.0为“”,>1.0为“”. 比较两组细胞中AFP表达量.

   统计学处理：用SPSS 10．0统计软件包分析，采用非参MannWhitney U两独立样本秩和检验.

   2结果

   2.1SP细胞及NonSP细胞的分选前向散射和侧向散射二维参数图证明受检细胞大小、形态、胞质均匀性一致，无PI染色细胞，无杂细胞干扰. 二维散点图中Hoechst red为X轴，Hoechst blue为Y轴，在细胞集中区域(P4)左下角(P2)另有小部分散点聚集（低Hoechst），而维拉帕米拮抗组无此区域，即SP细胞. 占受检细胞的1.8%（图1）. 对P2区域的SP细胞及P4区域的NonSP细胞进行分选，分别获得4×105及1×106个细胞.

   Hoechst red为X轴，Hoechst blue为Y轴.

   图1流式细胞仪二维散点图

   2.2AFP免疫细胞化学分析SP细胞及NonSP细胞爬片4 h后均贴壁，免疫细胞化学分析发现SP细胞及NonSP细胞胞质内均可见棕黄色颗粒，共计数SP细胞40个，NonSP细胞33个，表明SP细胞及NonSP细胞中AFP的表达有统计学差异（图2A，B，表1）.

   3讨论

   原发性肝癌的发生机制是国内外肿瘤研究的热点领域. 有学者提出肿瘤细胞和干细胞都具有幼稚的细胞表型，并提出肿瘤的干细胞起源假说［4］. 随着研究的深入，已有多种方法应用于肿瘤组织中具有干细胞样特性的肿瘤细胞的分离. 利用干细胞对多种染料具有排斥性的特异性功能标志，结合荧光激活细胞分选法，可得到低荧光并表现为边缘性聚集的SP细胞）［1-2］，目前这种分离富集干细胞样细胞的方法最为先进.

   A: SP细胞;  B: NonSP细胞.

   图2SP和NonSP细胞AFP表达SABC ×200表1SP细胞及NonSP细胞中AFP的表达

   肿瘤细胞和干细胞在无限增值、多向分化及自我更新机制等方面具有相似性. 肿瘤异质性理论也被广泛证实. 近年在白血病、乳腺癌、中枢神经系统肿瘤的研究中发现在肿瘤组织中只有少数细胞具有无限增生和致瘤的潜能［5-7］. 而大多数细胞只有有限的克隆扩增、形成肿瘤及自我更新潜能，干细胞样肿瘤细胞的不对称分裂产生细胞质、细胞器不均分布，分裂后形成两个不对称细胞的机制可能是肿瘤异质性的根本原因. AFP属胚胎类抗原，作为一种胚胎时期或病理状态的基因表达产物，它伴随着胚胎发育和细胞分裂旺盛的过程. 早有多方研究证实肝癌组织AFP表达率明显高于癌旁. 中、低分化肝癌中AFP阳性率明显高于高分化肝癌. 肝癌细胞分化程度愈低，原始性程度越高，合成的AFP越多，AFP表达水平从一定程度上可判断肝癌细胞的分化程度. 本研究我们通过流式细胞荧光激活分选法富集了干细胞样肝癌细胞，并用免疫细胞化学方法证实在肝癌细胞中AFP表达存在明显差异，仅极少部分细胞AFP表达呈强阳性，且绝大多数分布在SP细胞亚群中, 提示仅有少量克隆扩增、形成肿瘤及自我更新能力强的、更为原始的干细胞样肿瘤细胞高表达AFP，而这部分细胞与肿瘤的、复发、转移及耐药关系更为密切, 进一步证实了肿瘤的异质性，也有助于解释近30％肝癌患者存在AFP阴性或低浓度表达的临床现象.

   【】

   ［1］ Guo Y, Follo M, Geiger K, et al. Side population cells from different precursor compartments［J］. Hematother Stem Cell Res,2003,12(1):71-82.

   ［2］ Preffer FI, Dombkowski D, Sykes M, et al. Lineagenegative side population cells with restricted hematopoietic capacity circulate in normal human adult blood: Immunophenotypic and functional characterization［J］. Stem cells,2002,20(5):417-427.

   ［3］ Chiba T, Kita K, Zheng YW, et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem celllike properties［J］. Hepatol, 2006,44(1):240-251.

   ［4］ Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells［J］. Nature,2001,414(6859):105-111.

   ［5］ AlHajj M, Wicha MS, BenitoHernandez A, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:3983-3988.

   ［6］ Dao MA, Arevalo J, Nolta JA. Reversibility of CD34 expression on human hematopoietic stem cells that retain the capacity for secondary reconstitution［J］. Blood, 2003,101(1)112-118.

   ［7］ Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors［J］. Cancer Res,2003,63(18):5821-5828.