椒目油对哮喘豚鼠白细胞介素4,5及气道反应性的影响
【关键词】 椒目油；哮喘；白细胞介素
【Abstract】 AIM: To explore the effects of Jiaomu Oil on interleukin4,5 in serum and airway hyperresponsiveness (AHR) of asthmatic model in guinea pig and to provide theoretical basis for treatment of asthma using Jiaomu Oil . METHODS: This experiment included 4 groups: normal control group, asthmatic model group, dexamethasone treatment group and Jiaomu Oil treatment group, involving 10 guinea pigs in each group. Asthmatic models in guinea pigs were constructed by immunization of intraperitoneal injection with saline ovalbumin (OVA) and challenge of inspiration with nebulized OVA. A threeway cannula was inserted into the lumen of the trachea for mechanical ventilation and the intratracheal pressure (IP) was measured simultaneously for reflecting airway responsiveness. The levels of IL4,5 in serum of guinea pigs were determined using enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: The levels of IL4,5 of asthmatic model group［(38.2±3.4) and (344.4±21.8) ng/L］ were significantly higher than those of normal control group［(19.8±1.2) and (77.8±26.0) ng/L］(P<0.01). The levels of IL4,5 of Jiaomu Oil［(22.8±3.5) and (89.2±38.7) ng/L］and dexamethasone groups［(22.0±1.8) and (234.6±35.1) ng/L］were both significantly lower than those of asthmatic model group(P<0.01). The level of IL4 of Jiaomu Oil group didnt have any significant difference from that of dexamethasone group(P>0.05), While the level of IL5 of Jiaomu Oil group was significantly lower than that of dexamethasone group(P<0.01). The airway responsiveness of asthmatic model group ［(0.013±0.014) g/L］ was significantly higher than that of normal control group ［(0.168±0.186) g/L, P<0.01］. Compared with that of asthmatic model group, the airway responsiveness of Jiaomu Oil ［(0.160±0.180) g/L］ and dexamethasone group ［(0.144±0.154) g/L］ both decreased significantly (P<0.01), but they didnt have any statistical significance from that of normal control group (P>0.05). The airway responsiveness of Jiaomu Oil group didnt have any statistical significance from that of dexamethasone group (P>0.05). CONCLUSION: Jiaomu Oil could efficiently decrease the AHR of asthmatic guinea pig. The mechanism may be that Jiaomu Oil could prevent the production of IL4,5 in asthmatic guinea pig.
【Keywords】 Jiaomu Oil; asthma; interleukin4; interleukin5; airway hyperreactivity
【摘要】目的： 探讨椒目油对哮喘豚鼠模型白细胞介素4,5(IL4,5)水平及气道高反应性(AHR)的影响，为椒目油哮喘提供理论依据. 方法： 实验分为4组： 正常对照组、哮喘模型组、地塞米松治疗组和椒目油治疗组，每组各10只豚鼠. 用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏和雾化吸入激发建立哮喘豚鼠模型，三通管做气管插管进行机械通气，测定气道内压力(IP)以反映气道反应性，ELISA法检测豚鼠血清中IL4,5含量. 结果： 哮喘模型组豚鼠血清IL4,5含量［分别为(38.2±3.4)和(344.4±21.8) ng/L］显著高于正常对照组［分别为(19.8±1.2)和(77.8±26.0) ng/L］(P<0.01)；椒目油组IL4,5含量［分别为(22.8±3.5)和(89.2±38.7) ng/L］和地塞米松组IL4,5含量［分别为(22.0±1.8)和(234.6±35.1) ng/L］均明显低于哮喘模型组(P<0.01)；椒目油组豚鼠IL4含量与地塞米松组比较无统计学意义(P>0.05)，但IL5含量显著低于地塞米松组(P<0.01). 哮喘豚鼠模型组气道反应性(0.013±0.014 g/L)与正常对照组(0.168±0.186 g/L)比较显著升高(P<0.01)；椒目油治疗组与地塞米松治疗组气道反应性［分别为(0.160±0.180)和(0.144±0.154) g/L］与哮喘模型组比较均显著降低(P<0.01)，与正常对照组比较无统计学意义(P>0.05)；椒目油组气道反应性与地塞米松组相比无显著性差异(P>0.05). 结论： 椒目油能有效降低哮喘豚鼠AHR，其机制可能是抑制哮喘豚鼠体内IL4,5的生成.
【关键词】 椒目油；哮喘；白细胞介素4；白细胞介素5；气道高反应性
支气管哮喘是一种变态反应性疾病，IL4,5在其发病机制中占重要地位［1］. 目前临床上治疗哮喘多以对症为主. 中药椒目治疗哮喘悠久，疗效显著，但对其止哮平喘的作用机制还不清楚. 我们旨在通过探究椒目油对哮喘豚鼠血清IL4,5含量及气道高反应性(Hyperresponsiveness, AHR)的影响，揭示椒目治疗哮喘的作用机制，为椒目油运用于临床提供理论依据.
1材料和方法
1.1材料健康雄性豚鼠40只，体质量(250±50) g（第四军医大学实验动物中心）；椒目油(第四军医大学西京药剂科，批号： 20050221)；卵白蛋白(OVA, Sigma公司)；磷酸组胺(上海丽珠东风生物技术有限公司)；戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，批号： F20041117)；豚鼠IL4,5 ELISA试剂盒［美国Repidbio(RB)公司］；401AI超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)；动物呼吸机DH140B(浙江医科大学医学仪器实验厂)；PTM9医用微机实控仪(二道生理仪)，RM6280多道智能生理信号记录系统(第四军医大学病理生教研室).
1.2方法
1.2.1豚鼠支气管哮喘模型的建立参照［1］. 每日激发豚鼠1次，共7 d. 每次激发直到豚鼠出现咳嗽、呼吸急促、腹肌紧张等哮喘症状时为止.
1.2.2实验分组及处理用随机数字表法将豚鼠分为4组： 正常对照组、哮喘模型组、地塞米松治疗组和椒目油治疗组，每组各10只. 正常对照组用等量生理盐水致敏和雾化激发. 哮喘模型组用OVA致敏激发. 地塞米松治疗组致敏激发方法同哮喘模型组，但激发后立即给予5 g/L地塞米松溶液雾化吸入5 min. 椒目油组致敏方法同哮喘模型组，激发后立即给予椒目油和熟精油的混合物(按1∶1混合)，以3 mL/kg灌胃.
1.2.3气道反应性的测定参照文献［2］，以气道内压力(IP)上升至基线值的20%时所对应的磷酸组胺浓度(PC20)做为体现气道反应性高低的指标.
1.2.4测定IL4,5含量气道反应性测定完毕后，从豚鼠心脏直接抽血5 mL，静置30 min后以2000 r/min离心. 收集上层血清，运用ELISA法测定血清IL4,5的含量，具体步骤参照试剂盒说明书.
统计学处理： 所有数据均以x±s表示. 将原始数据输入SPSS 11.0统计软件包，气道反应性的组间比较运用KruskalWallis H法和Nemenyi法检验；IL4,5含量的组间比较运用SNKq（StudentNewmanKeulsq）法检验. 显著性水平均为0.05.
2结果
2.1模型动物大体表现哮喘组豚鼠在诱喘过程中出现哮喘发作症状，不同程度地表现为咳嗽、呼吸急促、腹肌紧张、四肢瘫软、行动迟缓或俯卧不动. 椒目油组和地塞米松组豚鼠激发后症状的表现程度较同期哮喘组明显减弱.
2.2病表现与正常对照组相比，哮喘模型组豚鼠肺外观体积增大，表面略肿胀，有不规则暗红色充血区及多处小米粒大小的红色出血点，支气管和肺泡腔内黏液分泌明显增多. 哮喘组肺组织切片(图1B)与正常对照组(图1A)对比显示：支气管壁及支气管周围组织有多处红细胞聚集区，且有大量炎细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸粒细胞(EOS)、单核细胞等；气道黏膜上皮增厚，气道变窄，严重者可见脱落. 上述病理表现证明哮喘模型建立成功. 椒目油组豚鼠肺大体表现：体积无明显变化，表面充血区及出血点有明显吸收的痕迹，面积明显小于哮喘组，出血点数量也明显减少；切片表现为小气道及肺泡壁结构完整，支气管和肺泡腔内分泌物显著减少，肺组织炎性细胞浸润明显减少，无气道狭窄及气道上皮细胞脱落等现象(图1C). 地塞米松组病理表现(图1D)与椒目油组相似，但炎性细胞的减少较椒目油组弱.
2.3各组间豚鼠血清IL4,5含量及AHR水平的比较哮喘组豚鼠IL4,5含量与正常对照组相比均显著升高(P<0.01，表1)；椒目油和地塞米松组IL4含量较哮喘组均显著降低(P<0.01)，但与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05)；两组IL5含量较哮喘组均显著降低(P<0.01)，椒目油组降低更为明显，已接近正常对照组，然而地塞米松组的IL5下降幅度较小，其水平虽低于哮喘组，但仍高于正常对照组(P<0.01)；椒目油与地塞米松两组之间IL4含量比较无统计学意义(P>0.05)，但两组IL5含量比表1各组豚鼠IL4,5及AHR水平
3讨论
AHR是哮喘的重要特征，也是临床诊断哮喘的主要依据. 气道炎症、气道平滑肌细胞反应性及气道重建是哮喘发病机制的三个主要因素，其中气道炎症为首发因素. 与哮喘关系密切的IL4,5是多种炎症细胞所释放的细胞因子，在AHR的发生和中占有重要地位. 豚鼠肺组织病理切片的结果表明椒目油能够减轻哮喘发展过程中引起的组织充血水肿、炎性细胞浸润甚至出血坏死等病理改变. 椒目油的上述作用可能与其减少IL4,5合成及释放有关.
IL4是一种多功能细胞因子，主要由活化T细胞和单核细胞分泌，是Th2细胞的特征性细胞因子. 它可通过对B细胞受体的去抑制作用而活化B细胞，从而介导体液免疫应答反应［3］. IgE是介导I型超敏反应的重要介质，IL4对IgG向IgE转型有促进作用［4］；IL4与受体结合可引发受体异源二聚化并激活信号转导和转录激活因子6(STAT6)，诱导MHCⅡ类抗原及免疫球蛋白受体基因等表达［5］，从而产生更多的IgE. IL4还促进EOS浸润和血管细胞黏附分子1(VCAM1)、 P选择素等多种黏附分子的表达［6］. 因此IL4在哮喘的发生发展过程中具有重要作用. IL5是一种作用于EOS的血源性生长因子，主要由活化T细胞产生，哮喘时IL5mRNA可增加300倍. IL5可活化EOS，同时也是EOS的趋化剂，上调其黏附分子(如CD11b)的表达，促进EOS同内皮细胞黏附，此作用可能与慢性变态反应性疾病中组织损伤有关［7］.
我们的实验结果显示：椒目油能显著降低哮喘豚鼠血清中IL4,5的含量，其降低IL4含量的效果与地塞米松相仿，但降低IL5含量的效果强于地塞米松；同时椒目油能够显著降低哮喘豚鼠AHR，其药效与地塞米松降低豚鼠AHR的效果相仿. 而在我们另外的实验研究中发现椒目油还有抑制单核细胞及EOS的作用(资料本文未显示)，说明椒目油具有抑制炎症细胞和前炎性细胞因子释放的抗炎作用，进而降低AHR，达到治疗哮喘的目的.
特有的中西医结合疗法针对哮喘“急则治标(西医解痉，中医降气)，缓则治本(补肾固本)”的方法，使哮喘患者获得较长时间的缓解期［8］. 中药椒目为芸香科植物花椒干燥成熟的种子，该药味苦、辛、性寒，具有行水消肿之功效. 有许多关于椒目治疗哮喘的报道［9-10］，但大多数是从临床效果来说明，而缺乏药理学基础. 我们从抑制炎性因子和降低AHR出发研究椒目油治疗哮喘的机制，从而为椒目治疗哮喘提供药理学基础. 另外椒目油富含Ca, Mg, Fe, Zn, Sr和Mn等人体必须的矿物质，同时还具有适用范围广、起效时间短、维持时间长、副作用少、来源广泛及价格低廉等优点，因此做为一种新型哮喘治疗药物，椒目油具备良好的开发前景.
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