盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析

         作者：于江天，苏金，任婷婷，刘新平

【关键词】  盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化

    【Abstract】 AIM: To find a way of detecting the ectopic expression of discoidin domain receptor 2(DDR2) in the cell and of tracing dynamically the expression distribution of DDR2 protein. METHODS: The fusion construct of DDR2 with EGFP was obtained by PCR amplication and restriction enzyme digestion, and transfected into 293T cells. The expression of the green fluorescence protein was examined by inverted microscope and the expression and activation of this fusion protein was confirmed by Western blot. RESULTS: DDR2/EGFP fusion plasmid was successfully constructed. Further analysis also demonstrated that the fusion protein has similar expression and activation pattern with wild type ones. CONCLUSION: The success in constructing the fusion plasmid DDR2/EGFP and in detecting its phosphorylation can lay a foundation of studying the function of DDR2.

    【Keywords】 discoidin domain receptor 2, fusion vector, EGFP, phosphorylation

    【摘要】 目的： 寻找使盘状结构域受体2（DDR2）在细胞内的表达情况易于检测并能动态追踪其蛋白表达分布的途径. 方法： 采用PCR技术扩增获得DDR2编码区无终止码序列，通过限制性酶切将DDR2片段亚克隆入pEGFPN3载体中，转染293T细胞后通过倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并用免疫印迹技术检测融合载体的表达及胶原刺激后活化状况. 结果： 成功构建了DDR2/EGFP融合表达载体，进一步的分析也证明此融合表达载体能在细胞中正确表达并可以被配体所激活. 结论： DDR2/EGFP的成功构建及可进一步检测磷酸化，为深入研究DDR2的功能奠定了基础.

    【关键词】 盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化

     盘状结构域受体2(Discoidin Domain Receptor 2, DDR2)属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶，可被天然纤维型胶原活化［1-2］，从而介导基质金属蛋白酶(MMP1,2和13)的表达［2-4］. 本实验室的前期研究［5-7］发现，DDR2在类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平. 为了深入研究DDR2介导的信号转导过程，我们旨在克隆其cDNA序列并将其以易于检测的形式进行表达.

    1材料和方法

    1.1材料大肠杆菌DH5α菌种和293T细胞为本室保存；引物由赛百盛公司合成；克隆载体pMD18T, Taq酶, dNTPs, dATP, 各种限制性内切酶及T4连接酶（TaKaRa公司）；DMEM培养基和新生小牛血清（Gibico公司）；pEGFPN3表达载体和抗EGFP抗体（Clontech公司）；抗酪氨酸磷酸化抗体4G10（Upstate公司）；DNA提取及回收试剂盒（天为公司）；PCR模板为本室构建的pMD18TDDR2; Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）; Westernblot所用发光底物（Pierce公司）; Olympus IX71荧光倒置像差显微镜.

    1.2方法

    1.2.1引物设计将DDR2全长无终止码序列命名为WSFDDR2（Without Stopcode Full length DDR2），根据GenBank中人DDR2分子序列（编号NM_006182）设计引物如下： 上游引物UW 5′ GCAAGCTTCCAGTTCCAACACCATCTTCTGAG 3′，其中引入HindⅢ酶切位点；下游引物DW 5′   GCGGTACCCTCGTCGCCTTGTTGAAGGTGCAG 3′，其中引入KpnⅠ酶切位点.

    1.2.2PCR扩增及产物修饰在100 μL反应体系中加入10×反应缓冲液10  μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL，模板使用本室保留的pMD18TDDR2质粒稀释液6 μL, 10  μmol/L上、下游引物各4 μL, pfx高保真DNA聚合酶2 U，补水至100 μL. 扩增条件为94℃ 5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 68℃ 2 min，后3个步骤重复循环30次. 扩增产物回收后以30 μL TrisHCl（pH 8.0）溶解，并进行加“A”反应： 50 μL反应体系中加入5 μL 10×反应缓冲液，4 μL dATP,  25 mmol/L MgCl2 3 μL，扩增产物30 μL, rTaq酶0.5 μL，补水至50 μL，反应条件为72℃ 40 min.

    1.2.3PCR产物克隆及序列测定将上述加“A”后的PCR产物回收，回收片段克隆到pMD18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定和测序.

    1.2.4重组表达载体pEGFPN3WSFDDR2的构建用HindⅢ/KpnⅠ将测序成功的WSFDDR2片段从pMD18T载体中切下，并连接入pEGFPN3载体中，构建出重组表达载体pEGFPN3WSFDDR2，并进行酶切鉴定（图1）.

    1.2.5基因瞬时转染将293T细胞培养于含100 mL/L新生小牛血清的DMEM培养基中，按照说明书将pEGFPN3空载体和重组表达质粒pEGFPN3WSFDDR2用Lipofectmine2000转染入70%汇合的293T细胞.

    1.2.6胶原刺激在293T细胞瞬时转染DDR2/EGFP融合表达载体16 h后，以无血清DMEM培养过夜，然后将30 mg/L的胶原加入到无血清DMEM培养基中继续与细胞孵育2 h.

    1.2.7裂解细胞及Westernblot分析收取转染或经胶原刺激后的细胞，裂解获得总蛋白，裂解液的成份包括： 50 mmol/L HEPES（pH 7.5）, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 10 mL/L NP40, 2.5 g/L脱氧胆酸钠，10 mg/L抑蛋白酶肽，10 mg/L亮抑制肽，1 mmol/L苯甲基磺酰氟, 1 mmol/L Na3VO4和50 mmol/L NaF. 取20 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE分离，然后电转移至硝酸纤维素膜，5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗孵育过夜，PBST洗膜，然后与辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗室温孵育1 h, PBST洗膜后加入发光底物孵育5 min，于暗室中用X光片曝光、显影、定影.

    2结果

    2.1人DDR2无终止码编码区序列的克隆及鉴定通过PCR扩增，成功获得长度为2565 bp的WSFDDR2片段（图2A），克隆入pMD18T载体后进行酶切鉴定时，由于pMD18T载体大小与 WSFDDR2分子大小接近，所以通过WSFDDR2片段内部已有的酶切位点BamHⅠ鉴定（图2B），酶切产物凝胶电泳见1200 bp左右条带，表明鉴定成功.

    2.2pEGFPN3WSFDDR2融合载体的构建测序成功的pMD18TWSFDDR2载体经HindⅢ/KpnⅠ/ScaⅠ三酶切，琼脂糖凝胶电泳显示出2500, 1700， 900 bp 3条条带，2500 bp为DDR2片段，1700 bp和900 bp条带是pMD18T经ScaⅠ酶切后的产物. 将2500 bp的片段回收后与HindⅢ/KpnⅠ双酶切后的pEGFPN3载体连接. 重组载体经酶切鉴定，可见到2500 bp左右的特异条带（图2C），pEGFPN3WSFDDR2融合载体构建成功.

    2.3DDR2/EGFP融合蛋白的表达鉴定在293T细胞瞬时转染DDR2/EGFP融合表达载体24 h后，于荧光显微镜下观察发现DDR2/EGFP能够成功表达并能被激发出绿色荧光，但较EGFP蛋白弱（图3A,B），部分细胞中绿色荧光位于核内（图3C）. 用抗EGFP抗体检测融合蛋白的表达，发现在150 ku左右有一特异性条带，符合预期分析. 在转染pEGFPN3的细胞中只在30 ku左右有一特异条带出现，分析其为表达的EGFP蛋白（图4A）.

    A: 对照组293细胞转染空载体pEGFPN3×100; B: 实验组293细胞转染融合载体pEGFPN3WSFDDR2×100; C: 融合载体表达分布，箭头所指为部分细胞核内的荧光×200. 图3倒置荧光显微镜观察293细胞的结果

    2.4DDR2/EGFP融合蛋白的活化转染DDR2/EGFP融合载体的293T细胞经胶原刺激后，用抗磷酸化酪氨酸的特异性抗体4G10在融合蛋白表达的相应位置检测到了融合蛋白的酪氨酸磷酸化形式（图4B），提示此融合蛋白能够被配体激活并发生酪氨酸磷酸化.

    3讨论

    在哺乳动物细胞中表达外源基因常需加上蛋白标签，常用的蛋白标签有Myc, His, Flag, HA及GFP等. 除EGFP外的标签均只有十几个氨基酸，然而表 A1: 对照组, pEGFPN3转染293T细胞; 2: 实验组, pEGFPN3WSFDDR2转染293T 细胞后24 h; B胶原刺激前后pEGFPN3WSFDDR2融合蛋白的磷酸化水平检测.图4293T细胞中WSFDDR2/EGFP融合蛋白的表达及磷酸化水平的检测

    达出的融合蛋白无法进行活体的追踪. EGFP的分子质量适中(只有30 ku)，将EGFP基因和目标基因构建在一起表达融合蛋白，EGFP无论构建在目标蛋白的N端，还是C端，都不会影响目标蛋白的构象. 更重要的是由于可以借助荧光显微镜等手段追踪目标蛋白在活体细胞中的表达，因此，EGFP作为报告基因，已经成为蛋白定位研究的主要手段和方法之一［8］.

    由于DDR2是一个膜表面受体，其锚定于膜表面依赖于其N末端21个氨基酸残基的信号肽，因此我们将EGFP融合于其C末端. 虽然融合蛋白发出的绿色荧光易于在荧光显微镜下观察，但比较单纯EGFP的荧光强度则相对弱很多. 提示DDR2由于分子质量相对较大（120 ku左右），可能在空间上对EGFP荧光的激发有阻挡效应.

    DDR2的活化主要依赖于其胞内区的激酶结构域，我们将EGFP融合在DDR2的C末端，可能对其活化产生一定的影响. 因此我们检测了融合蛋白受配体激活后的活化状况，发现Ⅰ型胶原刺激可以使融合蛋白发生酪氨酸磷酸化. DDR2作为膜受体，一般情况下应该大多数定位于膜表面，这与我们的观察是一致的，但我们仍能看到有些细胞中核部位有明显的荧光出现，提示DDR2可能有部分发生了核转位. 受体核转位的现象已有很多报道［9］. 因此，我们在后续的研究工作中将通过间接免疫荧光及荧光共聚焦实验进一步分析DDR2是否能够发生核转位，及核转位发生的条件和生物学意义.

    【】

    ［1］ Vogel W. Discordin domain receptors: Structural relations and functional implications［J］. FASEB J, 1999,13（Suppl）:S77-S82.

    ［2］ Vogel W, Gish GD, Alves F, et al.  The discoindindomain receptor tyrosine kinases are activated by collagen［J］. Mol Cell, 1997,1(1):13-23.

    ［3］ Olaso E, Ikeda K, Eng FJ, et al. DDR2 receptor promotes MMP2mediated proliferation and invasion by hepatic stellate cells［J］. J Clin Invest, 2001,108（9）:1369-1378.

    ［4］ Xu L, Peng H, Wu D, et al.  Activation of the discoidin domain receptor 2 induces expression of matrix metalloproteinase 13 associated with osteoarthritis in mice［J］.  J Biol Chem, 2005,280（1）:548-555.

    ［5］ 王吉村，药立波，吕后山，等. 类风湿性关节炎滑膜细胞中蛋白酪氨酸激酶的RNA表达水平分析［J］. 解放军医学杂志，2001,26（2）:5-8.

    ［6］ Wang J, Lu H, Liu X, et al. Functional analysis of discoidin domain receptor 2 in synovial fibroblasts inrheumatoid arthritis［J］.   J Autoimmun, 2002,19(3):161-168.

    ［7］ Ikeda K, Wang LH, Torres R, et al. Discoidin domain receptor 2 interacts with Src and Shc following its activation by type I collagen［J］. J Biol Chem, 2002,277(21):19206-19212.

    ［8］ 汪恒英，周守标，常志州，等. 绿色荧光蛋白（GFP）研究进展［J］. 生物技术，2004,14（3）:70-72.

    ［9］ Klaus D, Claus M, Birgit F, et al. Radiationinduced epidermal growth factor receptor nuclear import is linked to activation of DNAdependent protein kinase［J］. J  Biol  Chem, 2005,280（35）:31182-31189.