血栓性心脑血管疾病与血小板微颗粒及其膜功能蛋白表达的关系

          作者：苏冰，王前，孙德华，曾芳银，刘飞，张梦宇，齐涛

【关键词】  脑血管疾病；心血管疾病；血小板微颗粒；流式细胞术；CD62P,GPIIb/IIIa

　　【Abstract】 AIM: To detect platelet microparticle (PMP), glycoprotein IIb/IIIa (PAC1) and Pselection (CD62P) using whole blood flow cytometry (WBFCM) in whole  blood before and after the treatment in patients with ischemic cardiovascular and cerebrovascular diseases and the activation ratio of PAC1 and CD62P, and to explore the role of PMPs, PAC1 and CD62P in the pathogenesis of thrombotic cardiovascular and cerebrovascular diseases as well as the clinical significance of detecting PMP  and activation ratio of PAC1 and CD62P in whole blood in the prediction of illness state and in the prognostic evaluation. METHODS: The quantity of PMP and activation ratio of CD62P and GPIIb/IIIa were measured before and after the treatment of patient group and control group using flow cytometry. RESULTS: ① Control group PMP: (65.5±9.8)/104Plt, CD62P: (3.2±0.8)%, PAC1: (7.0±1.0)%; PMP:(64.3±8.3)/104Plt, PAC1:(6.8±0.7)%, CD62P: (3.0±0.7)%, PMP:(64.3±8.2)/104Plt, PAC1:(6.8±0.7)%, CD62P:(3.0±0.7)%; ② Before treatment of patient group(with thrombotic cardiovascular disease): PMP:(209.2±21.9)/104Plt, CD62P: (54.7±7.8)%, PAC1:(87.4±7.1)%; After treatment: PMP:(117.9±11.9)/104Plt, CD62P:(25.2±6.3)%, PAC1:(46.2±5.1)%;  They were  significantly higher than those in control group(P<0.01), and  significantly lower after treatment of patient group than before treatment(P<0.01). ③ Before treatment of patient group(with thrombotic cerebrovascular disease): PMP:(217.3±36.6)/104Plt, CD62P:(52.8±9.3)%, PAC1:(79.9±6.8)%;  After treatment: PMP:(134.2±12.9)/104Plt, CD62P:(24.3±6.1)%, PAC1:(42.2±5.1)%;  They were  significantly higher than those in control group(P<0.01), and  significantly lower after treatment of patient group than before treatment(P<0.01). CONCLUSION: The levels of PMP, PAC1 and CD62P can be taken as  the specificity indices for the evaluation of therapeutic efficacy, prognostic judgement and clinical diagnosis. And it provides theoretical basis for the longterm medication therapies for cardiocerebrovascular diseases.
 
　　【Keywords】 cerebrovascular disease;  cardiovascular disease;  plateletderived micropartisles; flow cytometry; CD62P; GPIIb/IIIa

　　【摘要】 目的： 运用以全血为标本的流式细胞仪(FCM)检测血小板微颗粒(PMP)方法，检测观察血栓性心脑血管疾病患者前后PMP及其表面膜糖蛋白GPIIb/IIIa(PAC1)及P选择素(CD62P)的活化比率的变化；探讨PMP及PAC1及CD62P活化比率检测在血栓性心脑血管疾病发病机制中的作用及其在病情预测和预后评价中的意义. 方法： 采用流式细胞仪分别对正常对照组、治疗前和治疗后血栓性心脑血管疾病组进行测定，分析各组PMP表达状况， CD62P, GPIIb/IIIa活化比率. 结果： ① 正常对照组PMP： (65.5±9.8)/104Plt, CD62P：  (3.2±0.8)%, PAC1: (7.0±1.0)%; PMP:(64.3±8.3)/104Plt, PAC1:(6.8±0.7)%, CD62P:(3.0±0.7)%, PMP:(64.3±8.2)/104Plt, PAC1:(6.8±0.7)%, CD62P:(3.0±0.7)%；② 血栓性心血管疾病组治疗前PMP:(209.2±21.9)/104Plt, CD62P:(54.7±7.8)%, PAC1:(87.4±7.1)%；治疗后PMP:(117.9±11.9)/104Plt, CD62P:(25.2±6.3)%, PAC1:(46.2±5.1)%；两者的PMP, CD62P, PAC1水平均较正常对照组有显著性升高(P<0.01)；治疗后较治疗前有显著性下降(P<0.01). ③ 血栓性脑血管疾病组治疗前PMP:(217.3±36.6)/104Plt, CD62P:(52.8±9.3)%, PAC1:(79.9±6.8)%; 治疗后PMP:(134.2±12.9)/104Plt, CD62P:(24.3±6.1)%, PAC1:(42.2±5.1)%；两者的PMP, CD62P, PAC1水平均较正常对照组有显著性升高(P<0.01)；治疗后较治疗前有显著性下降(P<0.01). 结论： PMP及其表面膜糖蛋白PAC1及CD62P表达的检测可作为血栓性心脑血管疾病疗效及预后判断的临床辅助诊断特异性指标之一，并为心脑血管疾病患者长期药物治疗提供理论依据.
 
　　【关键词】 脑血管疾病；心血管疾病；血小板微颗粒；流式细胞术；CD62P GPIIb/IIIa

　　0引言

　　心脑血管疾病是严重威胁人类健康的疾病，其死亡率、致残率居各种病因之首. 大量研究证明循环血小板活化升高与血栓性心、脑血管疾病的发病机制密切相关［1-5］. 血小板在正常的循环血液中处于静息状态，当血管内皮损伤或在某些生理或病理因素作用下，血小板发生活化反应，导致动脉内血栓形成. 近年来的流式细胞术(FCM)测定活化血小板膜糖蛋白为评价血小板在体内的活化程度提供了准确特异性的指标. 本研究我们建立了全血法测定血小板微颗粒PMP的方法，同时检测GPIIb/IIIa/CD62P的表达，并深入研究血小板活化在血栓性心脑血管疾病中的重要作用，为临床患者诊断、疗效观察及指导临床用药等方面提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料PAC1 FITC为异硫氰酸荧光素标记的抗血小板活化GPIIb/IIIa，即纤维蛋白原受体(FibR)的McAb; CD62p PE为藻红蛋白标记的抗P选择素的McAb; CD41a PerCP为多甲藻素叶绿素标记的抗血小板GPIIb/IIIa抗体(均购自美国BD公司)；流式细胞仪三色校准微球(CaliBRITE 3 Kit)美国BD公司；多聚甲醛(PFA)分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心；PBS磷酸盐缓冲液，pH 7.2德国医学实验诊断有限公司；FACSFlowTM鞘液美国BD公司；FACS Calibur流式细胞仪、Falcon上样管及CTAD真空采血管（内含潘生丁防止血小板体外活化），均为美国BD公司产品.
 
　　1.2方法

　　1.2.1研究对象① 正常对照组： 门诊健康查体30(男15，女15)例，平均年龄30岁. 体检正常，既往无心脑血管、高血压、糖尿病病史，测定前2 wk内未服用影响血小板功能的药物. ② 心血管疾病组： 冠心病患者40(男25，女15)例，年龄(55±8)岁，其中不稳定性心绞痛(UA)20例，稳定性心绞痛(SA)10例，心肌梗死(MI)10例，均符合WHO制定的血栓性心脏病的诊断标准，患者入院前无服药史. ③ 脑血管疾病组：患者38（男24，女14）例，年龄(65±8)岁，均符合全国第四届脑血管病会议制定的血栓性脑血管疾病诊断标准, 患者入院即刻采血，经住院治疗后3  wk病情有明显缓解再次采血.
 
　　1.2.2样本采集各组患者及正常对照的样本采集均用CTAD真空采血管采集的静脉血样2.7 mL. 弃去前2 mL混有组织液的血液，将剩余样本用枸橼酸钠抗凝，轻轻混匀， 取10 μL全血样本备用. 心血管疾病组及脑血管疾病组患者采入院时的静脉血以及经治疗后3wk症状缓解时的静脉血.

 
　　1.2.3样本制备对照管内加入PAC1 FITC, RGDS, Mouse γ1 PE, CD61a PerCP各10 μL；试验管加入PAC1 FITC, CD62p PE, CD61a PerCP各10 μL；然后将样本分别加入对照管和试验管各5 μL，轻轻混匀，避光室温孵育20 min，立刻加入预冷2~8℃的10 g/L多聚甲醛0.5 mL并混匀，放置于2~8℃冰箱中30 min. 以上步骤均在1 h内完成，以减少血小板体外活化. 标本制备好后在24 h内检测完毕.

　　1.2.4FCM测定校准流式细胞仪后，在CellQuest软件环境中，将流式细胞仪的前向角散射(FSC)，侧向角散射(SSC)及三色荧光(FL1~FL3)的检测信号均设置为对数放大,以CD61 a PerCP阳性为获取条件，在CD61vsSSC点图中设门找出血小板群，在单个血小板和血小板微颗粒所在位置圈门，计数门内10000个血小板，分别检测对照管和试验管中PMP与血小板群的光散射及三色荧光强度，并分析PMP占血小板总数的比率，用血球计数仪测定血小板的浓度，通过公式：PMP×109=PMP%×(血小板×109)/血小板%，出PMP的绝对浓度. 对照管内同时测定活化血小板CD62P, GPIIb/IIIa活性表达比率.
 
　　统计学处理： SPSS11.5软件进行分析，实验结果均用x±s表示，运用方差分析、配对样本T检验、单独样本T检验以及线性分析统计方法进行检验分析，以P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　正常对照组、血栓性心血管疾病组前后及血栓性脑血管疾病组治疗前后PMP, CD62P, PAC1水平有一定变化(表1). 血栓性心、脑血管疾病治疗前后PMP, CD62P, PAC1水平均较正常对照组升高(P<0.01)，血栓性心、脑血管疾病治疗后分别较治疗前下降(P<0.01).

　　表1血栓性心、脑血管疾病组治疗前后与正常对照组间血小板活化水平比较(略)

　　bP＜0.01 vs正常对照；dP＜0.01 vs血栓性心血管疾病治疗前；fP＜0.01 vs血栓性脑血管疾病治疗前.

　　3讨论

　　近10几年来，随着生物化学、细胞生物学、免疫学和分子生物学的，使医学界对血栓性心脑血管疾病的认识进一步深化，为临床诊断、监测、治疗和分析预后提供了理论上的支持. 血小板活化在血栓性心脑血管疾病中的作用也随着检测技术的提高而成为研究的重要方向之一. PMP是近几年提出来的作为血小板活化重要标志的概念，现正逐渐受到人们的重视，其分析大致包括以下几个方面:PMP的计数和定量［6］，PMP相关功能分析(如促凝活性、活化膜蛋白)，PMP的生物学活性等. 鉴于流式细胞仪在检测血小板等一些微小颗粒方面的优势［7-8］,目前多数学者采用FCM检测PMP.

　　血小板活化后，颗粒膜蛋自在质膜上高水平表达，引起GPIIb/IIIa, CD62P的显著性改变. GPIIb/IIIa分子主要是纤维蛋白原受体,血小板活化时GPIIb/IIIa发生变构反应，形成血小板纤维蛋白原血小板结合状态，导致血小板聚集，而PAC1是针对这一结合位点的mAb，所以PAC1+也是活化血小板的一种标志［9］. CD62P选择性的分布于静止血小板内的α颗粒上，血小板活化后，α颗粒迅速与血小板膜融合并释放，使CD62P重新分布于血小板表面,所以CD62P在血小板表面的表达是血小板活化的特异性标志物［10-11］. PMP是血小板活化后由血小板浆膜脱落形成的，具有完整的膜结构，表面富含多种膜糖蛋白，具有重要的促凝血功能. 近几年，国外学者对PMP在血栓性疾病中的作用进行了大量的研究，目前国内尚未见系统性报道.
 
　　本课题我们国外，运用全血法检测血栓性心、脑血管疾病患者和正常对照组PMP, CD62P及PAC1水平. 测定结果显示，血栓性心、脑血管疾病患者和正常对照组在血小板活化水平，即在PMP的产生及血小板表面膜糖蛋白CD62P, GPIIb/IIIa的活化比率上存在显著性差异(P<0.01)，且随病情加重，PMP产生数量及血小板活化比率有增高的趋势，治疗后血小板活化水平与治疗前相比明显降低(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)，由于患者体内大量应用抗凝药物，临床症状缓解PMP数量下降，CD62P, GPIIb/IIIa活化比率降低，但为何患者治疗后血小板仍处于一定的活化状态，我们认为在血栓性心、脑血管疾病的发生发展过程中，血管壁存在器质性病变，形成了动脉斑块，造成引起血小板活化的因素(高切变力、胶原暴露、内皮损伤等)无法逆转，促成血小板活化的基础病因无法得到根本的改变，使得血小板处于长期活化状态，药物能一定程度的降低血小板的活化，但仍然不能完全消除这些致活化因素的作用，结果显示脑血管病人初次梗塞者治疗后PMP下降明显，而复发梗塞者下降不明显，仍呈现持续高水平，也表明血小板处于慢性活化状态可能是脑梗塞再发的原因之一，这一现象在心肌梗死患者中也可看到，因此有效控制心脑血管疾病患者再梗死是至关重要的，临床症状缓解后仍需要长期抗凝治疗是预防再梗死的关键. 血小板活化作为血栓性心、脑血管疾病发生的早期因素，准确的测定PMP、血小板表面膜糖蛋白CD62P, GPIIb/IIIa对更早的诊断和预防心、脑血管疾病的发生，以及监测心、脑血管疾病的治疗效果、判断其预后都有着重要意义. 因此采用FCM和荧光标记的血小板活化标志的mAb直接测定这三种指标可直接敏感的反映病理状态下人体内血小板活化的程度及功能状态，为临床诊断、预防、治疗监测血栓性心、脑血管疾病提供了一种有效的手段，为此类疾病的进一步深入研究提供了有效的技术支持.

　　【参考文献】

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