白眉蝮蛇蛇毒中L

         作者：魏晓龙，魏继福，黄阗，陈秋玉，刘岳宁，何韶衡

【关键词】  L

　　Acute lung injury induced by Lamino acid oxidase purified from Agkistrodon blomhoffii ussurensis venom

　　【Abstract】AIM:  To purify the Lamino acid oxidase from Agkistrodon blomhoffii ussurensis venom and study its effect on lung. METHODS:  An Lamino acid oxidase was purified from the snake venom of Agkistrodon blomhoffii ussurensis (ABULAO) by using a combination of HeparinSepharose FF column and QSepharose HP column. The BALB/c mice were injected iv with 50, 5, 0.5 μg ABULAO or saline. At 6 or 24 h following injection, mice were sacrificed and the lungs were dissected. Sections (4 μm) were prepared and stained with hematoxylineosin for light microscopic observation. The mean numbers of red blood cells (RBCs), intraalveolar polymorphonuclear leucocytes (IAPLs), alveolar septa polymorphonuclear leucocytes (ASPLs) in a highpower field and mean alveolar cavity area (MACA) with image software were calculated. RESULTS: ABULAO was purified to electrophoretic homogeneity. The molecular weight of the enzyme is 60 kD when examined by SDSpolyacrylamide gel electrophoresis. The calculations of RBCs, IAPLs, ASPLs and MACA in mice treated with ABULAO were significantly higher than those treated with saline (P<0.0125). CONCLUSION: ABULAO was purified by a twostep chromatographic process. The enzyme can induce serious acute lung injury when being injected into mice.

　　【Keywords】 Lamino acid oxidase; Agkistrodon blomhoffii ussurensis; Acute  disease; lung/injuries; mice, inbred BALB C

　　【摘要】目的： 从白眉蝮蛇蛇毒分离纯化L氨基酸氧化酶,并研究其对肺组织的影响. 方法： 通过HeparinSepharose FF及QSepharose HP从白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化得到一个L氨基酸氧化酶，命名为ABULAO. 给Balb/c小鼠静脉注射50 ，5，0.5 μg药物或生理盐水100 μL，每组6只，6 h或24 h后取材，肺组织常规切片，HE染色. 高倍镜视野下平均红细胞数（RBCs）、平均肺泡内多形核白细胞数（IAPLs）、平均肺泡隔多形核白细胞数（ASPLs）；用图像分析仪测平均肺泡面积(MACA). 结果： 纯化ABULAO并在SDSPAGE上测定其表观Mr约为60000. 与生理盐水组相比RBCs，IAPLs，ASPLs，MACA在注射ABULAO后有显著改变（P<0.0125）. 结论： 通过两步层析法分离纯化得到ABULAO,它能诱导小鼠发生严重的急性肺损伤.
 
　　【关键词】 L氨基酸氧化酶；白眉蝮蛇；急性病；肺/损伤；小鼠，近交BALB C

　　0引言

　　L氨基酸氧化酶广泛存在于蛇毒中. 它能专一催化L氨基酸的脱氨基作用，生成相应的α酮酸、氨和过氧化氢［1］. 该酶有抗菌、诱导水肿、溶血、出血、抗病毒、诱导细胞凋亡等活性［2］. 我们从白眉蝮蛇蛇毒中分离得到一个L氨基酸氧化酶并通过SDSPAGE测定其表观Mr约为60000，并对其诱导的急性肺损伤进行了研究，对进一步了解该酶的毒理作用及为临床诊治提供一些数据.

　　1材料和方法

　　1.1材料4~6 wk的Balb/c小鼠48只，雌雄各半，体质量（20±2）g. 按ABULAO剂量（0.5，5和50 μg）和取材时间（6和24 h）分成6组，另设生理盐水对照组，每组6只. 白眉蝮蛇蛇毒采自辽宁省，HeparinSepharose FF（肝素凝胶），QSepharose HP（Q凝胶）色谱填料购自Pharmacia公司；各种氨基酸底物，Odianisidine等购自Sigma公司；分子量标记物、电泳系统和电泳用试剂均购于BioRad公司. Coomassie PlusTM Protein Assay试剂盒购自Pierce公司. 其他试剂都是分析纯.
 
　　1.2方法

　　1.2.1酶的分离纯化①  样品处理： 取白眉蝮蛇蛇毒200 mg，溶解于5 mL A液（25 mmol/L TrisHCl缓冲液，pH 8.5）中，在4℃条件下，10000 r/min离心10 min，取上清上柱. ② 肝素凝胶亲和层析：整个纯化过程用?KTA Primer 自动纯化仪，肝素凝胶填料为HeparinSepharose Fast Flow，色谱柱体积25 mL，流动相B液为含有1 mol/L NaCl的A液. 用A液充分平衡到电导值稳定时，上蛇毒上清. 程序为：A液50 mL后，以0% B ~ 100% B线性梯度洗脱250 mL，再用100% B洗柱50 mL. 流速为2 mL/min，每管收集3 mL. ③ 阴离子交换层析：Q凝胶填料为QSepharose High Performace，色谱柱体积为75 mL. 用A液充分平衡到电导值稳定时，上肝素亲和层析下的穿过峰. 程序为：A液100 mL后，以0% B ~ 100% B线性梯度洗脱500 mL，再用100% B洗柱100 mL. 流速为2 mL/min，每管收集4 mL. 蛋白质含量用在280 nm的光吸收值变化表示.
 
　　1.2.2酶活性测定酶活性参照Ponnudurai等［3］的方法，并稍加修改，以L亮氨酸为底物，通过436 nm处光吸收值变化测定释放的过氧化氢量来计算酶活性. 在25℃条件下，每分钟消耗1 μmol L亮氨酸底物所需的酶量定义为一个酶活性单位. 反应体系如下： 0.1 mol/L TrisHCl 缓冲液（pH 8.5），含有20 μmol/L L亮氨酸，10 μmol/L Odianisidine，辣根过氧化物酶 (0.08335 nkat/L) 和L氨基酸氧化酶，总体积为100 μL. 反应在酶标仪（SPECTRA MAX 340PC (Molecular Device Corp)）中进行，反应速度用反应体系在436 nm处A值的改变来测定. 摩尔消光系数8.31×103 mol/（mol・cm）.
 
　　1.2.3蛋白质定量蛋白质浓度用Coomassie PlusTM Protein Assay试剂盒测定.
 
　　1.2.4SDSPAGE电泳SDSPAGE电泳，电泳分离胶的浓度(以体积分数表示)为0.125，浓缩胶的浓度为0.04，电泳电压120 V，考马斯亮蓝R 250染色. 纯化的L氨基酸氧化酶的相对分子量通过SDSPAGE得以确定.
 
　　1.2.5病检查用生理盐水将ABULAO稀释到所需浓度，100 μL溶液分别含有酶0.5， 5及50 μg. 经尾静脉注射生理盐水100 μL或相应剂量ABULAO，间隔6 h或24 h后颈椎脱臼处死. 取右肺下叶肺组织行40 g/L甲醛固定. 常规脱水透明，石蜡包埋，组织切片4 μm，苏木素伊红染色.
 
　　1.2.6计量病理学检测方法对每组小鼠的肺组织切片，随机观察6个高倍（40×10）镜视野，计算每个视野： ①  平均红细胞数（mean numbers of red blood cells，RBCs）；②  平均肺泡内多形核白细胞数（mean numbers of intraalveolar polymorphonuclear leucocytes，IAPLs）；③ 平均肺泡隔多形核白细胞数（mean numbers of alveolar septa polymorphonuclear leucocytes，ASPLs）；④ 平均肺泡腔面积（mean alveolar cavity area，MACA）：在图像分析仪(Leica QWin V2.6, Leica DMR)上每个图像正中划边长约500  μm“十”字，测定与“十”相交叉的肺泡面积.
 
　　统计学处理： 数据分析采用SPSS 11.0软件完成. 各组数据采用非参数秩和检验方法，P<0.05为有显著性差异. 组内多个实验组与同一对照组比较，P<0.0125 (α=α/K, K为重复比较次数+1)为有显著性差异.

　　2结果

　　2.1酶的分离纯化通过肝素凝胶亲和层析（图1），L氨基酸氧化酶活性以穿透峰的形式与蛇毒中能结合肝素的组分分开. 在随后的Q凝胶离子交换层析中（图2），共得到8个分离峰，L氨基酸氧化酶活性分布在第5峰内. ABULAO约占蛇毒总蛋白质含量的0.127，比活力为1.33×106 nkat/g.

　　注：箭头所示为含有L氨基酸氧化酶洗脱峰.

　　图1肝素凝胶亲和层析从白眉蝮粗毒中分离ABULAO （略）

　　箭头所示为含有L氨基酸氧化酶洗脱峰.

　　图2Q凝胶离子交换层析分离纯化ABULAO（略）

　　表1ABULAO的分离纯化（略）

　　2.2SDSPAGE及分子量测量

　　2.2.1SDSPAGE经上述纯化过程得到的L氨基酸氧化酶在SDSPAGE电泳图上显示为一条带（图3），其表观Mr约60000.

　　1：白眉蝮蛇粗毒；2：肝素凝胶下ABULAO活性峰；3：ABULAO还原电泳；4：蛋白分子量标准；5：ABULAO非还原电泳.

　　图3SDSPAGE电泳（略）

　　2.3肉眼观察    注射生理盐水组小鼠未见任何改变. 注射ABULAO 50 μg剂量作用后，6 h 组6只小鼠中的2只肺脏出现明显的斑点、肿胀； 24 h组6只小鼠肺脏均出现斑点，出血斑点明显较6 h组数量多、面积大、肺肿胀. 5, 0.5 μg剂量组肺脏均未见明显改变.
 
　　2.4组织学改变生理盐水组小鼠组织切片显示正常的肺组织结构（图4）. 蛇毒组小鼠肺组织改变主要表现为肺出血、充血，肺泡壁增厚，肺泡间隔毛细血管扩张、充血，肺泡腔内有大量炎症细胞浸润，伴有渗出. 0.5 μg组未见肺泡内出血；5 μg显示肺泡内少量出血；50 μg组广泛出血.

　　2.5计量病观察 结果 ① RBCs： 注射后24 h，5 μg组开始出现出血，50 μg 组出血更明显；注射后6 h，50 μg组才出现出血（P<0.0125，图5A）；② IAPLs：蛇毒组均出现炎症细胞渗出，经6 h 或24 h作用后炎症细胞渗出均呈量效关系；50 μg组6 h时肺泡内白细胞渗出最明显（P<0.0125，图5B）；③ ASPLs：注射后6 h，0.5 μg组出现肺泡隔炎症细胞数量增加；而注射后24 h，50 μg组才出现炎症细胞数量增加. 同一剂量6 h组较24 h组肺泡隔白细胞数量多. 5 μg组注射后6 h肺泡隔细胞最多（P<0.0125，图5C）；④ MACA：注射后6 h，50μg组肺泡面积出现增大；注射后24 h，0.5 μg组开始出现面积增大（P<0.0125，图5D）.   A：注射生理盐水6 h；B：50  μg注射后24 h组. 肺组织可见大量成团的红细胞；C：50 μg注射后6 h组. 肺组织可见出血、肺泡腔大量白细胞浸润；D：5 μg注射后6 h组. 肺泡隔可见大量的白细胞浸润及肺泡壁毛细血管充血；E：0.5 μg注射后24 h组. 肺间质血管及肺泡壁毛细血管充血.

　　图4注射盐水或相同剂量ABULAO后的小鼠肺组织光镜检查HE ×400（略）

　　3讨论

　　本研究通过两步层析法从白眉蝮蛇蛇毒中分离、纯化得到L氨基酸氧化酶. 通过SDSPAGE测定其表观Mr约为60000，与大多数报导的蛇毒L氨基酸氧化酶是一致. 但与孙等［4］从同一种蛇中分离出的L氨基酸氧化酶在分子量、亚基组成上有所不同. 可能与蛇种地区差异有关，不同地区烙铁头蛇蛇毒L氨基酸氧化酶有类似情况［5］.
 
　　ABULAO注射Balb/c小鼠之后，能引起其肺脏广泛出血. 来源于A.controtix laticinctus L氨基酸氧化酶有引起皮下出血的活性［6］. ABULAO所致肺内出血呈时间和量效关系. 光镜下0.5 μg组可见充血而未见肺泡出血；5 μg组肺泡内少量出血；50 μg组广泛出血. 有人认为L氨基酸氧化酶可以通过诱导血管内皮细胞凋亡和抑制血小板聚集等抗凝机制导致出血［7-8］. ABULAO在体内能引起肺内炎症细胞浸润，大量中性粒细胞聚集于肺组织是ALI早期的基本病理改变，也是导致ALI的重要因素. 该细胞释放氧自由基、蛋白溶解酶等介质直接损伤内皮细胞和实质细胞［9-10］. ABULAO可能通过上述途径直接或间接损害内皮细胞和肺上皮细胞，血管通透性迅速增加，引起肺内出血、水肿、肺泡气肿，导致急性肺损伤.

　　A：平均红细胞数(RBCs)；B：平均肺泡内多形核白细胞数(IPLs)；C：平均肺泡隔多形核白细胞数(AIPLs)；D：平均肺泡腔面积(MACA). 结果表示为：  x±sx (n=6). aP<0.0125 vs正常对照.

　　图5ABULAO诱导急性肺损伤的计量病理学分析（略）

　　ABULAO所致白细胞浸润、肺泡内聚集，50 μg组达到高峰，呈量效关系. 50 μg组作用6 h后比24 h组细胞数量明显增多，可能与该酶引起中性粒细胞凋亡或死亡有关. 切片观察肺泡隔增厚，与肺泡隔内含有扩张的毛细血管、间质水肿及炎症细胞浸润有关. 可能导致通气/血流比例失调，影响气体交换，导致低氧血症，甚至发生急性窘迫呼吸综合征［11］.
 
　　总之，ABULAO能引起小鼠急性出血性肺损伤，计量病理学的改变主要是红细胞及白细胞的增高，其严重程度与时间及剂量有关. 白眉蝮蛇咬伤人后，局部迅速红肿、甚至皮下淤血、呼吸困难. 这种现象可能与该酶所引起的损伤有关.

　　【】

　　［1］ Du XY, Clemetson KJ. Snake venom Lamino acid oxidase［J］. Toxicon, 2002,40(6):659-665.

　　［2］ Ali SA, Stoeva S, Abbasi A, et al. Isolation, structural, and functional characterization of an apoptosisinducing Lamino acid oxidase from leafnosed viper (Eristocophis macmahoni) snake venom ［J］. Arch Biochem Biophys, 2000,384(2):216-226.

　　［3］ Ponnudurai G, Chung MC, Tan NH. Purification and properties of the Lamino acid oxidase from Malayan pit viper (Calloselasma rhodostoma) venom ［J］. Arch Bionchem Biophs, 1994,313(2):373-378.

　　［4］ 孙明忠，丁兰，赵大庆，等. 白眉蝮蛇蛇毒L氨基酸氧化酶的纯化与表征［J］. 高等学校化学学报, 1999,20(1):37-41.
 
　　［5］ Wei JF, Wei Q, Lu QM, et al. Purification, characterization and biological activity of an Lamino acid oxidase from Trimeresurus mucrosquamatus venom ［J］. Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao, 2003,35(3):219-224.

　　［6］ Souza DH, Eugenio LM, Fletcher JE, et al. Isolation and structural characterization of a cytotoxic Lamino acid oxidase from Agkistrodon contotrix laticinctus snake venom: Preliminary crystallographic data ［J］. Arch Biochem.Biophys, 1999,368(2):285-290.

　　［7］ Araki S, Ishida T, Yamamoto T, et al. Induction of apoptosis by hemorrhagic snake venom in vascular endothelial cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1993,190(1):148-153.

　　［8］ Suhr SM, Kim DS. Identification of the snake venom substance that induces apoptosis ［J］. Biochem Biophys Res Commum, 1996,224(1):134-139.

　　［9］ 王鹏，海春旭，梁欣，等.小鼠PMN的耗竭对光气所致急性肺损伤的影响［J］.第四军医大学学报, 2004,25(8):741-743.

　　［10］ 李志斌，李志超，闫志强，等. 心房钠尿肽对脂多糖引起肺微血管内皮细胞损伤的作用［J］.第四军医大学学报, 2005,26(4):289-292.

　　［11］ Bhatia M, Brady M, Shokuhi S, et al. Inflammatory mediators in acute pancreatitis ［J］. J Pathol, 2000,190(2):117-125.