选择性神经离断咬肌神经动物模型的建立
作者：杜本军，柳大烈，苏冰，梁莉，刘玉生，郑键生
【关键词】 咬肌
Establishment of animal model of selectively denervated masseter in rabbits
【Abstract】 AIM: To design and establish the animal model of selectively denervated masseter, in order to provide experimental data and theoretical evidence for clinical surgery. METHODS: In a total of 105 experimental rabbits 5 rabbits were selected for masseter and nerve anatomy, and the others were randomly devided into 4 groups: Normal control group and 3 experimental groups (denervation of masseter nerve stem, of superior division of masseter nerve, and of inferior division of masseter nerve). In experimental groups, every rabbit served as its own control, that was, the right side was experimental side, and the left side was control side. The animal modle of selectively denervated masseter was established, and the thickness and weight of experimental masseter were compared with the normals by the examination of B type ultrasound and electron equiarmbalance.RESULTS: After the masseteric nerve hed been abscised, the thickness or weight of denervated masseter obviously became thinner or lighter. The thickness and weight of experimental masseter was changed to 50.77% and 54.01% of the normals in group A, to 75.97% and 75.93% in group B , to 79.11% and 77.08% in group C. CONCLUSION: The animal model of selectively denervated masseter had been successfully set up for the first time. The thickness and humid weight of denervated masseter changed differently after different nerves were selected to be abscised. So, the model was available and credible, and was adapted to be used in researching denervated masseter in rabbits.
【Keywords】 masseter muscle; denervation; ultrasonography; disease models, animal
【摘要】 目的： 设计及建立选择性失神经咬肌的动物模型，为临床外科提供实验资料和理论依据. 方法： 实验兔子共计105只，选取5只剥离咬肌，仔细解剖咬肌及神经，以明确其走行. 再将其余动物随机平均分为4组，1个正常对照组，3个试验组（离断咬肌神经干组、离断咬肌神经上分支组和离断咬肌神经下分支组），每只动物做自身对照，均以右侧咬肌为试验侧，左侧咬肌为对照侧. 建立选择性失神经咬肌动物模型，并行超声检测、质量测量，比较肌肉厚度及质量变化. 结果： 术后三组实验测咬肌厚度及质量均显著减小，分别减小至正常的50.77%, 75.97%, 79.11%及54.01%, 75.93%, 77.08%. 结论： 本实验解剖分离并选择性切断咬肌神经，首次成功建立了选择性切断咬肌神经的动物模型，离断不同的神经，咬肌的厚度及质量变化也不相同，但不影响实验动物的进食活动. 所以，本模型有效、可靠，适用于失神经咬肌的动物实验研究.
【关键词】 咬肌；失神经；超声检查；疾病模型，动物
0引言
在整形与再造外科中，咬肌应用非常广泛，解剖学上，咬肌及神经的研究也处于重要的位置. 因此，我们以兔子为实验对象，研究其咬肌及神经分布，建立了失神经咬肌的动物模型，比较术前、术后的咬肌变化，为咬肌整形探寻新方法，为临床外科提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料健康成年新西兰大白兔105只(南方医科大学南方实验动物中心提供)，均为白色，雌雄各半，体质量(3.52±0.56)kg.
1.2方法动物购回后，常规饲养3 d，随机选出5只，作咬肌解剖. 再将其余动物随机分为4组，1个正常对照组（N组），3个试验组（A, B和C组），每组25只动物. 试验组A组为离断咬肌神经干组；B组为离断咬肌神经上分支组；C组为离断咬肌神经下分支组，每只动物做自身对照，均以右侧咬肌为试验侧，左侧咬肌为对照侧. 正常对照组及每个试验组25只试验动物又随机分为2 wk试验组、4 wk试验组、8 wk试验组、12 wk试验组和24 wk试验组，每组5只.
1.2.1咬肌与神经的解剖颧弓下缘作一横切口，在骨膜下分离咬肌. 咬肌下缘与颧弓间咬肌平均长度定为咬肌长度. 分别测量在前、后1/3垂直线上肌肉下缘和神经支间的距离，以及神经与下颌角点间的最近距离. 同时用20倍手术显微镜观察咬肌神经和动脉的相关性.
1.2.2造模N组，动物不作处理，其余动物用氯氨酮静脉麻醉0.2 mL/kg，于右侧面部常规碘酒、乙醇消毒. A组，取颧弓下缘切口，长约1.0 cm，手术显露咬肌，并将支配咬肌的神经分离出来，在其神经入肌点0.5 cm处将咬肌神经干切掉0.5 cm. 分离出咬肌神经干后，继续在咬肌浅层和深层间向下分离，分出咬肌神经的上下两分支. 注意在手术中要仔细观察与神经伴行的血管分布，用尖镊将血管间的组织分离，不可将血管壁碰破. B组，在咬肌浅深两层间钝性分开，分离出咬肌神经的上分支并切掉0.5 cm. C组，继续分离出咬肌神经的下分支并切掉0.5 cm，缝合肌肉与切口，再于左侧面部常规碘酒消毒，作颧弓下缘切口，暴露咬肌剥离显露神经，并将咬肌浅深两层间钝性分开后缝合切口.
1.2.3术后处理术后在动物清醒之前，单独放饲养箱内用普通照明灯具保持动物体温，加速动物的苏醒，增加动物的存活率，24 h后常规检查手术动物的生理状况. 常规饲养，不予制动. 术后1 wk内，予肌注庆大霉素4万U/d.
1.2.4实验方法实验时间跨度为术后2, 4, 8, 12, 24 wk. ① 兔子进食活动观察： 各组动物在相同饲养条件和环境下，观察进食、饮水及活动情况. ② 超声检测： 根据超声测量可以比较活体间皮下脂肪、肌肉的差异［1］，活体肌肉的厚度和收缩长度［2］；观察肌肉厚度的变化，判断其萎缩的情况［3］. 本实验采用美国GE公司生产的LOGIC500型彩色多普勒超声诊断仪，7～10 MHz变频探头，扫描方式为B型超声、实时扫描，误差为1.03%［4］. 测量时将探头置于咬肌表面，调整角度，使之垂直于咬肌平面，在咬肌安松弛状态下冻结图像，并通过内置尺测量，精确度为0.1 mm［5］. 分别于造模后对自身对照侧、实验侧咬肌及正常对照组兔咬肌厚度进行测量. ③ 咬肌质量测定： 切取咬肌后，迅速用德国R/200D电子天平称咬肌质量(精确度1/100 000 g)，并记录数据.
统计学处理： 用SPSS12.0统计软件分析，实验数据以x±s表示, 采用析因方差分析，将正常组与各试验组阴性对照侧、手术侧咬肌进行比较，将各试验组阴性对照侧与手术侧咬肌进行比较，再将各试验组阴性对照侧与手术侧的差值作比较，P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1咬肌解剖共进行5只兔子咬肌及神经解剖，均在骨膜下将咬肌分离后，于下颌切迹处可见咬肌神经干. 咬肌下缘与颧弓间距离是（3.12 ± 0.31） mm (范围 2.81～3.41 mm)，为咬肌平均长度. 兔子咬肌分浅层和深层. 咬肌神经发自下颌神经，在浅层和深层间向下走行，并发出上下两支. 上支向前上和前下散开走行，后支向前下和后方分支，分布无（图1）.
A： 后支有2个分支；B： 后支有3个分支；C： 后支无分支.
图1咬肌神经的后支变异较大（略）
在咬肌前1/3垂线处，神经距离咬肌下缘（1.65±0.31） mm；在咬肌后1/3垂线处，神经距离咬肌下缘（2.97±0.73） mm. 咬肌主干与下颌角最近的距离是（1.60±0.21） mm. 大概3/4（75%）的咬肌神经与动脉有交叉. 咬肌神经走行分两种，一种是神经与表浅咬肌动脉中段相交叉，在血管上走行(75%)；另一种是神经与动脉无交叉(25%)(图2). 咬肌神经与浅表动脉伴行. 咬肌质量为（5.12±0.37）g.
A： 第一种类型，约占75%（神经走行在动脉上方，在肌肉中部与动脉相交叉）；B： 第二种类型，约占25%（咬肌神经与动脉伴行但无交叉）.
图2咬肌神经与表浅动脉的关系（略）
2.2兔子进食活动观察各组实验动物在相同条件和环境下饲养，正常进食和饮水，未见进食习惯和饮食方式及进食量的改变，神态及活动正常，未见躁动、消瘦、倦怠、拒食等异常情况发生.
2.3超声检测结果根据析因分析结果，正常组与A, B, C三组的阴性对照侧差异不显著（P分别为0.778, 0.871, 0.873）,单纯暴露咬肌没有造成咬肌厚度改变. A, B, C三组阴性对照侧与各自手术侧有显著性差异（P均为0.000），证明A, B, C三组均可对咬肌厚度造成显著的影响. 用各组阴性对照侧与手术侧作方差分析： A组与B组、A组与C组、B组与C组作两两比较（P分别为0.000, 0000, 0.045），检验结果显示三种实验方法在改变咬肌厚度效果上有显著差别. 从析因方差分析交互效应图可以看出，A组方法，在第24 wk咬肌缩减最显著，共缩减2.45 mm，咬肌厚度为术前的50.80%；B组方法，在第24 wk咬肌共缩减1.44 mm，咬肌厚度为术前的75.83%；C组方法，在第24 wk咬肌共缩减1.06 mm，咬肌厚度为术前的79.22%（表1）.
表1术后三组B超检测咬肌厚度变化（略）
aP<0.05 vs正常侧和阴性对照侧. 试验与对照组咬肌厚度间比较差异有显著性，P=0.000；A组与B组或C组间均有显著性差异，P=0.000；B组与C组间有显著性差异，P=0.045. N组： 正常组；A组： 离断咬肌神经干组；B组： 离断咬肌神经上分支组；C组： 离断咬肌神经下分支组.
从试验测咬肌厚度变化的时间看，A组咬肌厚度呈进行性下降，其中从第8 wk到12 wk下降最显著，从原咬肌厚度的69.08%下降到52.82%，12 wk至24 wk无显著变化. B组咬肌厚度从第2 wk开始下降，在第8 wk达到最小值，为原来咬肌厚度的71.91%, 12 wk时反而比8 wk时略大，12 wk至24 wk无显著变化，随后稳定在24 wk的75.83%水平. C组咬肌厚度从第2 wk开始呈平稳下降，在第8 wk达到最小值，为原来咬肌厚度的73.03%, 12 wk时反而比8 wk时略大，12 wk至24 wk无显著变化，随后稳定在24 wk的79.22%水平.
2.4咬肌湿质量根据析因分析结果，正常组与A, B, C三组差异不显著（P分别为0.656, 0.893, 0.753），单纯暴露咬肌没有造成咬肌湿质量改变. A, B, C三组阴性对照侧与各自试验侧有显著性差异（P均为0.000），证明A组、B组、C组均可对咬肌湿质量造成明显的影响. 各组阴性对照侧与试验侧作方差分析： A组与B组、A组与C组、B组与C组作两两比较（P分别为0.000, 0000, 0.380），检验结果显示A组与B组、A组与C组在改变咬肌湿质量效果上有显著差别，而B组与C组无显著性差异（表1，2）. 从析因方差分析交互效应图可以看出，用A组方法，在第24 wk时咬肌湿质量缩减最显著，共缩减3.15 g，咬肌湿质量为术前的54.07%. 用B组方法，在第24 wk湿质量共缩减1.69 g，咬肌湿质量为术前的75.93%. 用C组方法，在第24 wk湿质量共缩减1.59 g，咬肌湿质量为术前的77.22%（表2）.
从试验测咬肌湿质量减少的时间看，A组咬肌湿质量呈进行性下降，其中从第8 wk到12 wk下降最显著，从原咬肌厚度的65.24%下降到55.12%，12 wk至24 wk无显著变化. B组咬肌湿质量从第2 wk开始下降，在第8 wk达到最小值，为原来咬肌厚度的68.49%, 12 wk时反而比8 wk时略大，12 wk至24 wk无显著变化，随后稳定在24 wk的75.93%水平. C组咬肌厚度从第2 wk开始呈平稳下降，在第8 wk达到最小值，为原来咬肌厚度的70.11%，12 wk时反而比8 wk时略大，12 wk至24 wk无显著变化，随后稳定在24 wk的77.22%水平.
表2术后三组咬肌湿质量变化（略）
aP<0.05 vs正常侧和阴性对照侧. 试验与对照组咬肌厚度间比较差异有显著性,P=0.000；A组与B组或C组间均有显著性差异，P=0.000；B组与C组之间差异不显著，P=0.380. N组： 正常组；A组： 离断咬肌神经干组；B组： 离断咬肌神经上分支组；C组： 离断咬肌神经下分支组.
3讨论
本模型所选择的实验动物新西兰成年兔其咬肌都包括相同数量的Ⅰ型与Ⅱ型纤维，也是最的中型动物之一. 又因其是啮齿类动物，咬肌比较发达，进行咬肌研究时常被选用［6］，实用性较强. 而且在建立动物模型时，根据解剖准确选择性分离切断所需要的神经，所以本次建立的模型是有效可靠的.
咬肌肥大畸形是整形外科常见的畸形之一，特别是东方人更为常见，咬肌肥大畸形虽不影响功能，但由于面部不协调，影响美观. 其病因至今仍然未明，目前临床上对于咬肌良性肥大畸形的以往多以手术切除部分肥大的咬肌为主，伴有下颌角骨质肥大的患者需要同时截除或磨去部分骨质，然因手术创伤较大、并发症多、去除咬肌或下颌骨截除的多少也没有明确的标准，全凭术者的经验. 关于下颌骨截骨术中是否去除咬肌，以及去除范围的界定仍然缺乏理论依据，所以需要探寻一种创伤小、标准明确、效果好的治疗方法.
动物建立后，实验侧咬肌或部分咬肌处于失神经支配状态，咬肌或部分咬肌不能产生收缩功能、丧失对应力的反应能力，同时也失去神经细胞产生的肌肉营养物质，会出现肌纤维逐渐萎缩、体积变小、质量下降. 但各组实验动物在相同条件和环境下饲养，正常进食和饮水，未见进食习惯和饮食方式及进食量的改变，神态及活动正常，未见躁动、消瘦、倦怠、拒食等异常情况发生.
神经损伤离断后，营养因子的更新换代是骨骼肌发生萎缩的最主要原因［7］. 同时，骨骼肌失去神经支配作用后, 肌纤维处于松驰状态，不能产生收缩功能，丧失对应力的反应能力，体积变小，肌纤维逐渐萎缩，肌细胞也发生一系列改变. Stein等［8］认为四肢肌对重力刺激反应的丧失导致肌纤维结构的重新塑形，在长期卧床、太空失重状态飞行等情况尤为常见. 而且失神经支配的骨骼肌，还处于制动状态，制动对骨骼肌也有明显的萎缩作用［9］.
从本实验结果可知，离断神经后，会出现咬肌的厚度逐渐变小、质量逐渐下降，离断不同的神经，咬肌的厚度及质量变化也不相同，萎缩幅度在失神经15 d内最大，与许多研究结果一致［10-11］. 现已证实，失神经腓肠肌2 wk时咬肌质量下降45%左右，4 wk时咬肌质量下降约70%［12］. 可见，在相同时间段，离断神经后，咬肌质量下降幅度比其他部位的骨骼肌质量下降幅度小.
咬肌为闭口肌群中的一组肌肉，在失神经状态下，也会与不停被动运动有关，肌肉发生被动性的缩短与拉长，通过咬肌被动运动产生对血液回流的“泵样”挤压作用，一方面促进了肌肉血液循环，加速了静脉及淋巴回流，减轻组织间水肿，缩短血液中氧及营养物质与肌细胞之间的弥散距离，有利于肌肉内氧及代谢产物交换，另一方面通过被动地将肌纤维拉长与缩短，使肌肉保持一定的弹性［13］. 所以失神经后咬肌的变化不同于其他骨骼肌.
本动物模型能够自始至终的模拟出失神经咬肌由表及里的变化过程，可以对咬肌变化作认真细致的观察研究，在国内外还未见到类似实验模型的报道.
【】
［1］ Oguri K, Zhao L, Du N, et al. Association of habitual longdistance running with the thickness of skeletal muscles and subcutaneous fat in the body extremities and trunk in middleaged men ［J］. Sports Med Phys Fitness, 2004,44(4):417-423.
［2］ Stafilidis S, Karamanidis K, MoreyKlapsing G, et al.Strain and elongation of the vastus lateralis aponeurosis and tendon in vivo during maximal isometric contraction ［J］. Eur J Appl Physiol, 2005,94(3):317-322.
［3］Tonseth KA, Gunther A, Brabrand K, et al. Ultrasonographic Evaluation of the Rectus Abdominis Muscle After Breast Reconstruction With the DIEP Flap ［J］. Ann Plast Surg, 2005,54(5):483-486.
［4］ Kubota M, Nakano H, Sanjo N, et al. Maxillo facial morphology and masseter muscle thickness in adults ［J］. Eur J Orthod, 1998,(20):535-542.
［5］赵继志,戴晴,赖钦声. 50例正常青年人咬肌厚度及其与面型关系的B型超声测量分析［J］. 医学院学报, 2001,23(1):60-62.
［6］施新猷. 医学实验动物学［M］. 北京： 人民军医出版社,2000:505-513.
［7］李刚,梁炳生. 失神经肌萎缩研究现状［J］. 实用骨科杂志,2003,9(5):433-435.
［8］ Stein T, Wade P. Protein turn over in atrophying muscle: From nutritional intervention to microarray expression analysis ［J］. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2003,6(1):95-102.
［9］倪国新. 制动对骨骼肌的影响［J］. 国外医学物理医学与康复分册,1999,19(2):60.
［10］宋浩东. 人骨骼肌失神经后细胞增殖状态的变化PCNA免疫组化研究［J］. 中华手外科杂志,1996,12:52-56.
［11］田涛，吴朝晖，金惠铭，等. 大鼠臂丛神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞凋亡的研究［J］. 中华医学杂志,2000,80(7):530-533.
［12］徐建广,顾玉东,李继峰. 大鼠失神经支配骨骼肌退变的实验研究［J］. 上海医科大学学报，1999,26(4):265-267,274.
［13］徐建广,顾玉东,李继峰. 被动活动对失神经支配骨骼肌超微结构及酶组织化学影响［J］. 骨与关节损伤杂志,2003,18(1):27-29.
