食管癌组织hMSH2 mRNA的表达和启动子区甲基化
【摘要】 目的：检测食管癌组织中hMSH2 mRNA的表达和启动子区甲基化异常. 方法：食管癌标本及相应正常食管黏膜组织32例. 原位杂交法检测hMSH2 mRNA的表达，甲基化特异PCR（MSP）法检测错配修复基因hMSH2启动子区甲基化. 结果：食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性表达率为46.9%，正常组织为84.4%（P<0.05）. hMSH2 mRNA阳性表达率与食管癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、浸润深度等均无关（P>0.05）. 食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率为34.4%，正常食管黏膜组织未发现甲基化，2组甲基化阳性率相比较差异有统计学意义（P<0.01）；高龄患者（≥70岁）癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率（85.7％）明显高于较低龄患者（<70岁）(20.0％)(P<0.05)；病理组织学Ⅲ,Ⅳ级食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率（70.0%）高于Ⅰ,Ⅱ级（18.2%）（P<0.05）. 食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性组启动子区甲基化的发生率（13.3%）低于hMSH2 mRNA表达阴性组（53.0%）（P<0.05）. 结论：hMSH2的表达缺失是食管癌发生的早期事件；食管癌组织中hMSH2基因启动子区甲基化与患者年龄和肿瘤病理类型可能有关；hMSH2基因的失活与其甲基化有一定关系.
【关键词】 食管肿瘤 hMSH2基因 mRNA 甲基化
0引言
是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，而河南林县及其相邻的辉县、安阳等地是我国也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区［1］. 我们应用原位杂交方法，检测了食管癌和正常食管组织中错配修复基因hMSH2 mRNA的表达，并结合患者的临床病理资料进行分析；应用甲基化特异PCR（MSP）方法检测食管癌组织中hMSH2基因启动子区的甲基化状态，探讨了其与食管癌发生、的关系.
1对象和方法
1.1对象食管癌患者32(男19，女13)例， 年龄50~78 (62.8±7.4)岁. 术前均未接受放化疗. 取其手术切除癌标本及相应正常食管黏膜组织，全部手术切除标本均经2位以上病专家诊断证实. 其中鳞癌25例，腺癌5例，腺鳞癌2例；组织学Ⅰ,Ⅱ级22例，Ⅲ,Ⅳ级10例；无淋巴结转移23例，有淋巴结转移9例；食管上段癌4例，中段癌16例，下段癌12例；肿瘤最大直径<5 cm 17例，≥5 cm 15例；浸润至黏膜1例，浸润至肌层18例，浸润至全层13例. 32例标本均于切除后0.5 h内，在癌灶及正常残端取约1 cm×1 cm×1 cm大小的组织块2份，一份40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋；另一份提取DNA.
1.2方法原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司. 所有操作均按说明书进行［2］. 标本采用蛋白酶Ｋ消化，酚／氯仿／异戊醇抽提，乙醇沉淀的经典方法提取ＤＮＡ. 应用CpGenome DNA Modification Kit(Intergen)试剂盒修饰DNA. PCR扩增参照［3］设计针对hMSH2启动子去甲基化和甲基化的特异性引物. hMSH2去甲基化引物序列为：5′?GGTTGTTGTGGTTGGATGTTGTTT?３′（正义），5′?CAACTACAACATCTCCTTCAACTACACCA?３′（反义），产物长度151 bp；甲基化引物序列为：5′?TCGTGGTCGGACGTCGTTC?３′（正义）,5′?CAACGTCTCCTTCGACTACACCG?３′（反义），产物长度150 bp. 反应总体积50 μL ，反应体系为10×PCR buffer(Mg2+ plus) (Takara) 5 μL, 2.5 mmol/L dNTP (TaKaRa) 4 μL， 20 μmol/L引物(Sangon)各1 μL, 修饰后DNA模板2 μL，83.35 mkat/L Taq DNA聚合酶（Takara） 0.5 μL ,循环参数：95℃变性5 min, 95℃ 50 s, 58℃(去甲基化)／56℃（甲基化） 50 s, 72℃ 50 s,循环36次，最后72℃延伸5 min. 原位杂交染色后DAB试剂盒进行最终的反应，镜下观察，以细胞胞质有棕色颗粒出现为阳性表达，胞质无着色为阴性表达. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，溴乙锭紫外灯下观察结果并记录.
统计学处理:组间比较计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验或Fisher?s精确概率, P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1食管癌组织中hMSH2 mRNA的表达阳性表达细胞主要是黏膜腺体的腺细胞，在细胞间质中有散在阳性细胞，阳性表达均在细胞胞质. 食管癌和正常食管黏膜组织中hMSH2 mRNA的阳性表达率分别是46.9%，84.4%（χ2=8.514，P=0.014）. hMSH2 mRNA阳性表达率与食管癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、浸润深度等均无关（P>0.05）.
2.2食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化状态32例癌组织中发现甲基化11例，占34.4%，未发现去甲基化；正常黏膜组织中发现去甲基化25例，未发现甲基化(χ2=12.947，P=0.0003). 食管癌组织中的hMSH2启动子区甲基化与患者性别、肿瘤大小、组织学类型、浸润深度和淋巴结转移均无关（P>0.05）；而与患者年龄、组织学分级有关（P<0.05，表1). 食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性组中甲基化的发生率（13.3%）明显低于hMSH2 mRNA表达阴性组中的甲基化发生率（53.0%）,其差别具有统计学意义（P<0.05）.表1食管癌组织中hMSH2基因启动子区甲基化与临床病理参数的关系
3讨论
人类错配修复基因能消除DNA生物合成中的错误，增加DNA复制的可信度，在防止自由突变方面起重要作用. 李华川等［4］发现hMSH2基因在食管癌组织中的表达明显降低. 我们应用原位杂交方法研究发现食管癌和正常食管黏膜组织中hMSH2 mRNA的阳性率分别为46.9%和84.4%，二者比较差异有统计学意义（P<0.05）. 进一步与临床病理资料联系研究发现，hMSH2 mRNA阳性表达率与患者年龄、性别，肿瘤大小、肿瘤位置、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、浸润深度等均无明显相关性（P>0.05）,提示hMSH2的缺失是食管癌的发生的早期事件. 阳性表达细胞主要是食管黏膜腺体的腺细胞，在细胞间质中有散在阳性表达，阳性表达部位均在胞质. 正常食管黏膜组织阳性表达时腺体细胞几乎全部表达，而食管癌组织阳性表达时仅部分腺体细胞阳性表达，说明其阳性强度也弱于正常组织，这与张钦宪等［5］所报道的在正常胃黏膜组织中的表达强度高于胃癌组织有相似之处.
我们应用MSP法检测食管癌组织中hMSH2基因启动子区甲基化状态，发现其阳性率为34.4%，正常黏膜未发现甲基化. 食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性组中甲基化的发生率明显低于hMSH2 mRNA表达阴性组（P<0.05），提示hMSH2启动子区甲基化与食管癌组织中hMSH2 mRNA的低表达有一定的关系，错配修复基因hMSH2 mRNA的异常变化与hMSH2基因启动子区甲基化有高度的相关性. 本研究食管癌组织中hMSH2 mRNA的阴性率为53.1%，食管癌组织中hMSH2基因启动子区甲基化的发生率为34.4%，这两个率的差异提示启动子区甲基化的异常是导致mRNA转录受阻的原因之一，另外还有原因导致mRNA的转录受阻. 然而hMSH2基因mRNA失表达的机制还有哪些，以及hMSH2基因启动子区异常甲基化导致hMSH2基因mRNA转录障碍的更具体机制需进一步研究. hMSH2启动子区甲基化与肿瘤的大小、部位、浸润深度及患者性别无关（P>0.05），而与患者年龄及肿瘤组织学分级有关（P<0.05），其中高龄患者（≥７０岁）癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率（85.7%）明显高于较低龄（﹤70岁）患者（20.0％）；Ⅲ,Ⅳ级hMSH2启动子区甲基化发生率（70.0％）高于Ⅰ,Ⅱ级（18.2%），这提示hMSH2基因启动子区甲基化可能参与了食管癌的过程，尤其在老年食管癌的发生发展中起一定作用. 由于目前分析的食管癌病例较少，还有必要增大研究样本量，进一步研究食管癌组织中hMSH2基因的表达情况及其与CpG岛甲基化的相关性.
【】
［1］ 王立东，郑树. 河南食管癌高发区人群食管和贲门癌变机制［J］.郑州大学学报:医学版，2002，37（6）：717-729.
［2］ 张功员，刘秋亮，马春晓，等.食管癌组织中hMSH2基因的表达［J］.第一军医大学学报，2004，26（6）：662-664.
［3］ Herman JG, Umar A, Polyak K, et al. Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(12):6870-6875.
［4］ 李华川，赵新吉，刘海玲，等.食管癌和贲门癌组织中错配修复基因表达的研究［J］.肿瘤杂志，2002，22（1）：23-25.
［5］ 张钦宪，杜鹃，乐晓平，等.胃癌组织错配修复基因hMSH2 mRNA的表达［J］.河南医科大学学报，2001，36（4）：379-382.
