人α防御素的稳定表达和活性鉴定
作者：刘娟 翟嵩 杜德伟 王临旭 王少扬 汪定成 孙永涛
【关键词】 人α防御素
Expression and functional characterization of human αdefensins
【Abstract】 AIM: To prepare secretary human αdefensin 1 and αdefensin 3 and to determine the functional characterization of their antimicrobial activities. METHODS: Eukaryotic expression vector pcDNA31/V5HisTOPOHNP1 and pcDNA3.1/V5HisTOPOHNP3 were cotransfected with plasmid pDCH1P11 (carrying dhfr gene ) into CHOdhfr- cells respectively and the recombinant protein was verified by ELISA. The stable expression cell strains were screened by selective medium containing G418 and then serially passaged in methotraxate (MTX) for gene amplification. The expressions were analyzed by ELISA, RT-PCR and IFA, and the bacteriastatic activities were assayed in vitro. RESULTS: The expression level of αdefensin1 ranged from 1885 ~ 4746 mg/L・48 h per 106 cells, while that of αdefensin3 was 1689 ~3557 mg/L・48 h. 303 bp segments were amplified from stably tranfectant clones and strong fluorescence was visible in cell plasma around the nuclear in the stably transfectant cells by IFA. KB disc agar diffusion test found obvious bacteriastatic diffusion on MH plate of E.coli. CONCLUSION: Human αdefensin 1 and αdefensin 3 are effectively secreted, which are of high antimicrobial activities. Our results lay the basis for the development of antiHIV1 activity by recombinant αdefensin 1 and 3 .
【Keywords】 human αdefensin; CHOdhfr;methotrexate
【摘要】 目的： 制备有较高生物学活性的分泌型人α防御素1与α防御素3,并初步鉴定其抗菌活性；方法： 将真核表达质粒pcDNA31/V5HisTOPOHNP1,3与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHOdhfr，ELISA检测到培养上清中重组蛋白的表达，对阳性表达的细胞进行G418筛选，对其中9个表达量较高的阳性克隆进行氨甲喋呤（MTX）加压扩增, ELISA法、RTPCR法及间接免疫荧光（IFA）分析蛋白表达情况，并同步测定其体外抗菌活性.结果： α防御素1的表达量是1885~4746 mg/L・48 h・106个细胞； α防御素3的表达量是1689~3557 mg/L・48h・106 个细胞.用RTPCR从稳定表达的细胞株中扩增出全长约303 bp的片段；IFA 显示稳定转染的细胞胞质核周质中有强的绿色荧光；KB纸片琼脂扩散法显示α防御素1,3在大肠埃希菌MH平板上形成了明显的抑菌圈.结论： 成功高效地表达了分泌型的α防御素1,3，并具有良好的生物学活性，为进一步探讨α防御素1,3对HIV1的抑制作用提供了物质基础.
【关键词】 人α防御素；CHOdhfr细胞；甲氨喋呤
0引言
防御素是在中性粒细胞和上皮细胞中发现的一族富含半胱氨酸残基的阳离子短肽.根据6个半胱氨酸残基的位置及二硫键连接的不同，将哺乳动物的防御素分为3类： α防御素、β防御素和环状防御素，它们具有强大而广谱的抗菌活性.人中性粒细胞中含有的α防御素又名人中性粒细胞多肽14（human neutrophil peptide14，HNP14）等，它们在中性粒细胞分化成熟前已合成，在生理情况下不能被诱导表达［1］.晚近又发现： 人α防御素13有抗HIV的作用［2，3］.然而，人体中的防御素含量很少、结构相似，通过分离提纯获得生物活性较高的防御素单组分还存在一定的技术难度，化学合成又成本太高.基因工程技术可以帮助人类获得特定的大量人类蛋白质，是获取目的蛋白的一个有效手段.因此，本课题将真核表达载体pcDNA31/V5HisTOPO HNP1,3在CHOdhfr系统中进行基因扩增表达，获得了大量分泌型的防御素，为基因工程生产防御素提供了可能的生产模式，也为进一步研究人α防御素1-3与HIV1的作用环节奠定了基础.
1材料和方法
11材料CHOdhfr由军事医学院基础研究所沈倍奋教授惠赠；真核表达质粒pcDNA31/V5HisTOPOHNP1，3由本室构建；大肠埃希菌标准质控菌株为ATCC25922；含dhfr 基因片段的质粒pDCH1P11由美国哥伦比亚大学Larry Chasin教授惠赠.
Superscript ⅡTM、lipofectamine2000购自Invitrogen公司，不含HT的CHO专用无血清培养基CHOSSFMⅡ购自Gibco公司,非必须氨基酸（NAA，100×）为Hyclone公司;MTX、次黄嘌呤、胸腺嘧啶（HT，50×）、左氟沙星（LEFX）为Sigma公司；α防御素1,3 ELISA kit、α防御素1,3鼠抗人单克隆抗体为荷兰HyCult 公司.异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的羊抗鼠IgG 购自北京中山试剂公司.上下游引物由上海生工公司合成（Genbank accession No： NM-005217481）： P1（上游引物）5′ AAAGGATCC ATGAGGACCCTCGCCATC3′；P2（下游引物）5′ AAAGAATTCTCAGCAGCAGAATGCCCAG3′，分别含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点.其扩增产物均为303 bp.
12方法
121pcDNA31/V5HisTOPOHNP1，3与pDCH1P11的共转染用含100 mL/L胎牛血清（FBS）、1×NAA、1×HT的DMEM培养基培养CHOdhfr细胞.24孔板中进行转染，转染之日细胞达到95%的融合，更换为无抗生素、无血清的CHOSSFMⅡ500 μL/孔；按照LF2000说明书进行转染操作.转染6 h后换含100 mL/L FBS的CHOSSFMⅡ（不含HT、NAA ）1 mL，继续培养48 h，ELISA鉴定阳性转染的细胞按1∶10传代，24 h细胞贴壁后换含选择性培养基（不含HT、NAA，但含G418 400 mg/L, FBS 100 mL/L）.14～16 d后有阳性克隆形成；因培养基中不含HT,故存活细胞为成功共转染的细胞.转染pcDNA31/V5HisTOPO HNP1/ HNP3后分别得到15个、24个阳性细胞克隆.用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板、又传代至12孔板，经ELISA测定对其中9株高表达的细胞克隆进行扩大培养.
122MTX诱导α防御素1,3的高效表达取2×104 个细胞接种于6孔板，更换5×10-8 mol/L的MTX加压培养，可见大部分细胞逐渐死亡，待存活细胞长至约全部融合时，测定重组蛋白分泌量；同样方法进行MTX为5×10-7 mol/L的加压扩增；对最高表达量的细胞株传代5次后用CHOSSFMⅡ 收液（G418维持剂量： 100 mg/L）.
123α防御素1,3表达情况的测定
1231蛋白表达水平的ELISA检测对G418筛选后的9个高效表达细胞株的培养上清及经MTX加压后的细胞上清用ELISA法测定蛋白含量，按α防御素1,3 ELISA kit 说明书进行操作.每组各3复孔的平均值，所有数据均用x±s表示.
1232阳性克隆株的RTPCR鉴定收集加压筛选后的细胞（2×106 /组），用Trizol进行总RNA提取, Superscript ⅡTM 反转录试剂盒合成cDNA, P1/P2为引物进行PCR反应，反应体系为95℃预变性 5 min后扩增，即95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸 30 s，35个循环，72℃终延伸10 min.
1233IFA测定稳定转染的细胞经爬片、固定、洗涤后，分别滴加1∶300稀释的α防御素1和3单抗，37℃湿育1 h；同法漂洗，滴加1∶50稀释的FIFC标记的二抗，最后于荧光显微镜下观察.空质粒pcDNA31(+)转染的CHOdhfr 为阴性对照.
124抗菌活性试验无菌条件下收集最高表达细胞株的无血清细胞培养上清，经过滤、冷冻干燥浓缩及重溶后，ELISA测定母液浓度，配制不同浓度的稀释液进行后续试验.根据Lehrer 等的方法［4］，并借鉴KB纸片琼脂扩散法［5］.将灭菌滤纸片放入浓度为A： 15 mg/L;B： 75 mg/L;C： 38 mg/L;D： 19 mg/L的稀释液和E: 阴性对照（含G418 50 mg/L）中浸泡12 h，室温阴干，阳性对照为1 g/L的LEFX.在接种05麦氏比浊大肠埃希菌菌液的MH平板上贴紧已浸泡过的纸片，35℃孵育16～18 h后，量取抑菌圈直径.
2结果
21ELISA检测α防御素1,3的表达经MTX扩增后，外源蛋白的表达量出现了大幅度的提高，α防御素1中最高一株的表达量扩增了近200倍，α防御素3中最高一株的表达量扩增了100倍（Tab 1）.
图1RTPCR法检测pcDNA31/V5HisT0P0HNP1、pcDNA3.1/V5HisT0P0HNP3稳定转染的细胞株 略
表1ELISA检测α防御素1,3的表达 略
22RTPCR法检测α防御素1 mRNA与α防御素3 mRNA的表达稳定转染的细胞株中扩增出303 bp大小的片段，而阴性对照组无相应条带（Fig 1）.
23在稳定转染的细胞，可见明显的绿色荧光弥漫分布于细胞胞质核周质中,提示目的蛋白表达于内质网腔.在有的细胞，位于核一侧的荧光尤为明亮，为典型的分泌型表达模式（Fig 2A，2B）.空质粒转染的阴性对照组仅见伊文氏蓝衬染的红色细胞核（Fig 2C）.
24抗菌活性测试在α防御素1测试平板： 阳性对照组可见直径为29 mm的抑菌圈；阴性对照组仅见 6 mm的抑菌圈（<10 mm均认定为阴性），其余不同浓度的α防御素1上清分别可见直径为26，22，22，18 mm的抑菌圈（Fig 3A）；在α防御素3测试平板： 阳性对照组可见直径为30 mm的抑菌圈；阴性对照组可见5 mm的抑菌圈，其余各不同浓度的α防御素3上清可见直径为25，23，16，5 mm的抑菌圈（Fig 3B）.
3讨论
艾滋病是严重威胁人类健康的疾病，举世公认的HAART疗法虽然可以延缓病情，改善症状，但是长时间的化学药物会对机体产生毒副作用及引发耐药毒株.1993年，人们发现了α防御素（包括大鼠中性粒细胞多肽、豚鼠中性粒细胞多肽、兔中性粒细胞多肽）对HIV复制的抑制作用［6］，但对其作用机制一直不明确.有研究表明防御素与HIV穿膜结构gp41（HIV Env蛋白583610）有着类似的结构和功能，包括与C1q结合、补体激活及PKC抑制作用［7，8］，可能是当防御素在影响细胞信号通路的同时，调控了HIV的感染与表达.2002年，发现了人α防御素13的抗HIV活性，且无任何细胞毒性［2］，同时有实验表明人α防御素抗HIV感染的作用表现在病毒穿入之后，但不参予HIV基因表达的抑制和LTR的激活［9］.然而HIV与α防御素相互作用的研究受限于防御素的有限来源.若从人中性粒细胞中提纯或人工合成，常常无较高的生物活性［5］.基于现状，我们利用基因工程技术，得到了有较高生物活性的重组人α防御素,为进一步探讨它们与HIV1的作用机制及应用研究奠定了物质基础.
CHOdhfr表达系统是目前较常用于表达外源蛋白的哺乳动物工程细胞系，由于CHOdhfr 细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（Hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活.而通过目的基因与dhfr基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于dhfr可被叶酸类似物MTX所抑制，在MTX浓度选择压力下，dhfr基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗MTX细胞系；又由于与dhfr基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着dhfr基因的扩增而扩增，我们就得到了能大量表达外源蛋白的细胞克隆，这在基因工程抗体及各种基因工程蛋白的表达中是可行度很高的一种措施［10，11］.实验中，为了提高转染效率，选用了完全无血清的、低蛋白的（<100 mg/L）的和便于外源重组蛋白表达的CHO专用无血清培养基进行转染操作；另外，在成功获得高表达的克隆并进行扩大培养、收液时，为避免血清对a防御素生物学活性的抑制作用［12］和防止对后续试验的干扰，仍用CHOSSFMⅡ.抗菌活性结果表明在相同浓度下，从抑菌圈的大小来看，α防御素3的活性略弱于α防御素1,这一实验结果与国外报道相似［13］.
致谢： 军事医学院基础研究所黎燕教授对本实验的细胞培养及加压扩增部分作了指导.
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