玻璃体内注射谷氨酸导致大鼠视网膜Müller细胞内ERK1/2磷酸化水平增高
【关键词】 谷氨酸
cnIntravitreal glutamate injection induces an increased phosphorylation of ERK1/2 in retinal Müller cells of rats
【Abstract】 AIM: To analyze the changes of phosphoERK1/2 in retinal Müller cells by using an intravitreal glutamate insult and to explore the neuroprotection role of activated (phosphorylated) ERK1/2 against glutamate cytotoxicity in retina. METHODS: A 2 μL of saline or glutamate (375 nmol) was injected into the random unilateral vitreous body for 3 d or 7 d in 18 SD rats. The rats were randomly divided into 3 groups: Control group (saline injections), glutamate injections 3 d group and glutamate injections 7 d group. The changes of the activated ERK1/2 were studied by immunohistochemical staining and computerpicture analytic system. RESULTS: After 7 d intravitreal glutamate insult, the activated phenotypes of retinal cells exhibited a hypertropic morphology and increased immunostaining for ERK1/2. By the staining pattern in shape and localization, the positive cells were presumed to be Müller cells. The gray level of glutamate injections 7 d group was the lowest among the 3 groups. The difference between glutamate injections 7 d group and other two groups was significant (P<005). CONCLUSION: Increased phosphorylated ERK1/2 in retinal Müller cells by using an intravitreal glutamate insult suggests that phosphoERK1/2 plays an important neuroprotective role when retinal ganglion cells are injured by glutamate cytotoxity.
【Keywords】 glutamic acid; retinal Müller cells; ERK1/2
【摘要】 目的： 观察大鼠玻璃体内注射谷氨酸后视网膜Müller细胞内ERK1/2分子的磷酸化水平，为探讨ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性损伤视网膜时的保护作用提供形态学证据.方法： SD大鼠18只，随机分为生理盐水对照组、谷氨酸注射后3 d组和7 d组，每组6只.随机选取大鼠的一只眼进行玻璃体内注射，实验组注射谷氨酸(375 nmol) 2μL， 对照组注射等量生理盐水，注射后3或7 d后，取出眼球作冰冻切片，采用免疫组化法显示视网膜中的含磷酸化ERK1/2的阳性结构，用图像分析比较对照组和不同实验组的平均灰度值.结果： 注射谷氨酸7 d组的视网膜Müller细胞内ERK1/2表达上调，其灰度值（9700±221）比对照组灰度值（12800±323）和注射谷氨酸3 d组的灰度值（12600±412）均低（P<005），与这两组的灰度值之间差异有显著性.结论： 玻璃体内注射谷氨酸导致大鼠视网膜Müller细胞激活，ERK1/2磷酸化水平增高，ERK1/2通路的激活可能在视网膜节细胞受到兴奋性毒性损伤时起到重要的保护作用.
【关键词】 谷氨酸；视网膜Müller细胞；ERK1/2
0引言
目前许多研究表明青光眼患者视神经节细胞（RGCs）凋亡是由于高眼压所致的机械性损害和谷氨酸增多的化学性毒性作用.谷氨酸是视网膜的组成成分之一，是感光细胞、双极细胞和神经节细胞的主要神经递质.但谷氨酸浓度过高时，会使其受体超兴奋，对神经细胞有明显的毒性作用，引起神经元的损伤和凋亡［1］.ERK1/2(extracellular signalregulated kinases,ERK1/2)，是MAPK家族的重要成员之一，对丝裂素、激素、兴奋性毒素等生理刺激和病理刺激均可作出不同的反应，控制着细胞的适应、增殖、分化、存活和凋亡的生理过程［2］.Siger等证明，雌激素可通过MAPK信号转导途径激活培养的大鼠皮质神经元的ERK1/2通路，对抗谷氨酸诱导的大脑皮质神经元的凋亡，但目前尚缺乏在体的证据.本研究于在体动物，观察了玻璃体内注射谷氨酸后视网膜Müller细胞内ERK1/2分子的磷酸化水平，为探讨ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性损伤视网膜时的保护作用提供形态学证据.
1材料和方法
11实验动物和分组选择18只SD大鼠（第四军医大学实验动物中心提供），体质量200～250 g，无眼疾，雌雄不拘.饲养环境： 光照时间6 AM~6 PM，光照强度330 lux，室温21℃.随机分为生理盐水对照组、谷氨酸注射后3 d组和7 d组，每组6只.
12谷氨酸注射模型的建立用10 ｇ/Ｌ戊巴比妥钠按 50 mｇ/kg行ip麻醉 ,用 5 ｇ/Ｌ丁卡因点眼2次行眼表麻醉，用10 μL的微量注射器（上海医用激光仪器厂）经颞侧巩膜刺入玻璃体内，处理组玻璃体内注射375 nmol的谷氨酸（美国Sigma公司，粉剂用生理盐水溶解）2 μL［3］，对照组眼内注射生理盐水2 μL.
13标本固定和切片每组模型建好后，动物成活3或7 d，然后用10 g/L戊巴比妥钠（80 mg/kg）行ip麻醉，麻醉后开胸,经心脏用100 mL生理盐水和40 g/L 多聚甲醛(pH 74)固定液500 mL灌注,取出眼球,用200 g/L蔗糖溶液后固定.将眼球用TissuTek包埋,在－20℃的冰冻切片机内做眼球矢状冰冻切片，片厚16 μm.切片在－20℃保藏.
14免疫组织化学染色采用免疫组化ABC染色法.10 mmol/L PBS漂洗5 min×3次；30 g/L H2O2封闭30 min； 10 g/L牛血清白蛋白和30 mL/L正常羊血清在室温分别孵育切片20 min；切片浸入3 mL/L Triton×100大约5 min；兔抗pERK1/2抗体（1∶1000,Sigma公司）室温下孵育切片24 h；生物素化的羊抗兔IgG（1∶500,Vector公司）室温下孵育4 h；生物素辣根过氧化物酶复合物（ABC,1∶500 Vector公司）室温孵育2 h；硫酸镍铵加强DAB蓝色反应呈色，当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应,贴片,脱水、透明、封片，光镜下观察并照相.
15图像分析采用Quantimement 570图像分析仪，放大倍数为40×，用Quic图像分析软件测得视网膜免疫反应强度（平均灰度，染色越深灰度值越小，最黑为0），每个切片随机选择3个视野，测定阳性细胞的灰度值，以平均值作为判断该大鼠视网膜上的pERK表达水平的标准.
统计学处理3组均数比较用方差分析，均数间多重比较用LSDt检验.设显著性水准α=005.统计分析采用SPSS110 软件完成.
2结果
21免疫组化结果pERK在各组动物视网膜均有表达，注射谷氨酸后7 d组表达最强，对照组表达最弱，注射谷氨酸后3 d 组介于两者之间.对照组pERK阳性产物只见于内核层和节细胞层，只标记了部分细胞突起，很少见阳性的细胞胞体（Fig 1A）；注射谷氨酸7 d组pERK的表达增强，不仅在内核层和节细胞层有很强的表达，在外丛状层和外界膜、内界膜（Müller细胞的突起）也有很强的表达，阳性标记的突起浓密而均匀，内核层可见有少量的胞体阳性着色，有部分区域可以看到阳性表达的细胞胞体和突起贯穿视网膜全层（Fig 1B）；注射谷氨酸3 d组和对照组基本一致，仅局限在节细胞和内核层（Fig 1C）.根据这些阳性细胞染色结构特征以及阳性着色的放射状突起从内界膜纵穿外界膜的特点，我们可以推断出ERK阳性细胞是视网膜Müller细胞.
图1视网膜Phospo-ERK1/2免疫组化染色 略
22图像分析结果经LSDt检验，注射谷氨酸7 d组的灰度值（9700±221）与对照组的灰度值（12800±323）和注射谷氨酸3 d组的灰度值（12600±412）之间均有差异（7 d组与对照组P1=0024,7 d组与3 d组P2=0031）.对照组与注射谷氨酸3 d组间无差异（P=0083）.
3讨论
本研究发现，在正常状态时，仅在视网膜节细胞层有少量的pERK1/2的阳性表达，当玻璃体内注射谷氨酸3 d后，在视网膜节细胞层和内丛状层ERK1/2通路激活略有增加，而在注射谷氨酸7 d后，视网膜的pERK通路大量激活，根据阳性细胞胞核和放射状突起纵穿视网膜的的特征性结构和其位于内核层的位置特点可以确定激活的细胞主要为Müller细胞，其增殖的细胞胞体肥大，细胞突起浓密而均匀，部分伸出的突起达外丛状层、外界膜和内界膜，甚至纵穿视网膜全层.Müller细胞在视网膜内起支架作用，胞体位于内核层，伸出放射状粗细不同的突起纵穿视网膜，形成了视网膜的内、外界膜，对维持细胞外和玻璃体内的谷氨酸水平起着重要的作用［4,5］.通常谷氨酸被Müller细胞迅速从细胞间质运走，在细胞内再转化成谷氨酰胺，通过谷氨酸/谷氨酰胺循环又以谷氨酸形式释放于突触间隙发挥兴奋性神经递质的功能.在玻璃体内注射谷氨酸后，视网膜细胞外的谷氨酸超过正常生理浓度，对神经元产生了毒性作用，机体通过自我保护和修复机制，激活了大量的Müller细胞来清除过量的谷氨酸，同时由于谷氨酸的毒性刺激导致Müller细胞的ERK1/2的磷酸化水平上调.由此可见，Müller细胞对视网膜神经元受到谷氨酸毒性损伤后的保护作用有部分可能是通过ERK通路的激活来完成的.Roth等［6］发现视网膜缺血6 h后Müller细胞的ERK表达增加，使用其抑制剂PD98059后，内核层变薄，RGCs凋亡增加，表明ERK的激活对视网膜缺血有神经保护作用.Orike等［7］研究发现大脑受到伤害性刺激后，星形胶质细胞和神经元的ERK1/2通路的激活可以抑制神经元的凋亡，促进神经元的存活，阻断ERK通路后，神经元的凋亡率显著增加，可见在大脑ERK通路的激活也起到了神经保护作用；聂亚雄［8］等研究发现脑溢安含药血清能上调谷氨酸损伤后的大鼠海马神经元的ERK水平，其抑制剂能阻断脑溢安对神经元的保护作用；通过上述研究结论结合本实验结果，我们可以推测玻璃体内注射谷氨酸后，一方面，机体通过自身保护机制调节大量视网膜Müller细胞激活，清除过量的谷氨酸；另一方面谷氨酸毒性刺激使得Müller细胞上的ERK通路的激活,既可以直接抑制神经元的凋亡，又可以将细胞外生长、分化信号转导至细胞核，启动核内转录因子，从而促进Müller细胞进一步的增殖和分化，为神经节细胞提供更多重要的营养物质和有利的生存环境，抑制神经节细胞的凋亡.本实验通过对在体谷氨酸毒性损伤时视网膜ERK信号通路的研究，为青光眼视神经保护提供了一个新思路.
【】
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