licD2基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降

                                            作者：蓝锴，单幼兰，袁军，孟江萍，张雪梅，尹一兵

【关键词】  缺陷

　　Deletion of licD2 gene leads to reduced virulence of Streptococcus pneumoniae

　　【Abstract】AIM: To assess the role of licD2 gene in the virulence of Streptococcus pneumoniae. METHODS:  licD2deficient strain was constructed and identified by PCR. Relative quantitative RTPCR was applied to measure the expression levels of virulent factors and the virulence was studied by mice survival test. RESULTS:  The expression of virulent factors in licD2deficient strain was lower than that of widetype strain  (P<0.05). The transformation capability of licD2deficient decreased obviously, even completely lost. Mice virulence experiments showed that the survival time of widetype strain was less than 1 d, while that of licD2 mutation was more than  2  weeks (P<0.001). The elimination speed of licD2 mutation in mice blood was faster than that of  the widetype. CONCLUSION:  The deficiency of licD2 gene leads to decreased transformation capability and the expression of virulent genes, thus markedly reducing the bacterial virulence.

　　【Keywords】 Streptococcus pneumoniae; virulence; reverse transcriptase polymerase chain reaction

　　【摘要】 目的： licD2是掌控肺炎链球菌生长所需物质胆碱代谢最重要的基因. 本研究探索licD2基因的缺陷是否影响细菌毒力.   方法： 采用插入复制失活的方法缺陷licD2基因，通过相对定量RTPCR分析其毒力因子表达情况，并利用动物体内试验观察licD2基因缺陷菌株毒力改变.   结果： RTPCR显示licD2缺陷菌株毒力因子表达低于野生菌，两组比较P＜0.05；转化试验发现缺陷菌株转化力下降甚至消失；小鼠毒力试验结果野生菌株半数致死时间＜1 d，而缺陷菌株半数致死时间为>14 d, P<0.001，差异有显著性；缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌.   结论： 结果提示licD2基因的缺陷使转化力下降，多种毒力因子表达减弱，细菌毒力降低.

　　【关键词】 链球菌，肺炎；毒力；逆转录聚合酶链反应

　　0引言

　　目前应用最广泛的23价肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）多糖疫苗，虽然效果较好，但是该疫苗不是蛋白类疫苗、免疫原性较弱，对免疫力低下的人群如老年人、幼儿等预防效果较差［1］. 最新研制出以破伤风和白喉类毒素作载体的11价S.pn结合疫苗对婴幼儿有很好的免疫原性，但也仅仅限于2岁以下的幼儿［2］. 因此要彻底解决S.pn感染的防治，仍需深入理解肺炎链球菌致病的分子机制. 胆碱作为S.pn所需的生长因子，在链球菌细胞分裂、转化和自溶等生物学特性中有着不可替代的作用. 链球菌表面的磷脂酰胆碱可直接与宿主细胞表面作用，从而促进黏附和侵袭［3］. 磷脂酰胆碱还是大量内皮和上皮细胞表面血小板活化因子受体（plateletactivating factor receptor, PAFR）的黏附配体，S.pn利用胆碱与此受体结合后对宿主细胞的黏附和侵袭会明显增加［4］. 磷脂酰胆碱还是将胆碱结合蛋白（cholinebinding proteins, CBPs）这一大类毒力因子家族锚定于细菌表面不可缺少的“锚”［5］. 近来发现细胞表面磷脂酰胆碱抗原决定簇的表达需要lic1位点，包含有4个基因，即： licA, licB, licC和licD. 在众多的基因位点中，仅有licD2缺陷后S.pn的多种生物学显型，如胆碱摄取能力、转化力、青霉素诱导自溶等才发生显著变化［6］,但具体的机制尚不清楚. 我们拟构建licD2基因的缺陷株，研究该基因缺陷后细菌毒力的变化，并从细菌毒力基因的表达、细菌在体内存活情况等方面探讨分析导致细菌毒力下降的原因.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　S.pn血清3型（CMCC 31203）购自医学微生物菌种保藏中心，主要特征经鉴定合格： 血培养呈光滑、半透明、扁平小菌落伴草绿色溶血环、胆汁溶菌试验阳性、Optochin试验阴性. S.pn液体培养基为C+Y半合成培养基，含5 g/L酵母抽提物（Lacks and Hotchkiss, 1960）. 质粒筛选用氯霉素LB平板，及氯霉素LB液体培养基. 血培养用TSA血平板，含50 mL/L兔脱纤维全血. 含氯霉素TSA血平板筛选整合有质粒染色体的缺陷菌. 转化试验用含红霉素TSA血平板. S.pn CPM8染色体DNA（含有红霉素抗性基因erm）、感受态刺激肽（competencestimulating peptide, CSP），质粒pEVP3由美国Morrison DA教授惠赠. 胶回收试剂盒（大连宝生物工程有限公司），PCR试剂（上海生物工程技术服务有限公司），琼脂糖（BBI公司），Marker（MBI公司），RNA提取试剂盒为RNeasy Mini Kits（德国Qiagen公司），随机引物，上海博亚生物技术有限公司合成（其他引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1）. 逆转录酶MMVL及其试剂（Promega公司）.表1各基因引物序列（略）

　　1.2方法

　　1.2.1licD2缺陷菌株的构建构建重组质粒：以31203的DNA为模板，PCR扩增licD2. 循环条件： 94℃ 30 s, 42℃ 30 s, 72℃ 40 s, 30次循环；20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收. 分别用限制性内切酶XbaⅠ, Sau3aⅠ和XbaⅠ, BglⅡ将licD2和pEVP3进行双酶切，胶回收，Marker定量后将两者连接. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α后铺于氯霉素LB平板（250 mg/L），挑选阳性菌落，在含氯霉素的LB液体培养基（25 mg/L）中增菌，37℃恒温振荡培养3～6 h后提取重组质粒. 用HindⅢ酶切并用pEVP3测序引物进行PCR扩增，鉴定重组质粒是否构建成功. 构建缺陷菌株： 将31203在CTM培养基（10 mL C+Y中含1 mmol/L的CaCl2和2 g/L BSA）中增菌至A620 nm＝0.08左右，取100 μL菌液加入5 μL重组质粒和1 μL CSP, 37℃水浴90 min，铺于含氯霉素的TSB平板（2.5 m g/L），37℃孵箱培养24～48 h，挑取血平板上的菌落（缺陷菌株），于含氯霉素（2.5 mg/L）的C+Y培养基中增菌，保存并提取DNA.

　　1.2.2licD2缺陷菌株的鉴定PCR鉴定： 分别以31203野生菌株及其licD2缺陷菌株（△licD2）DNA为模板，以licD2上游引物和pEVP3测序下游引物进行PCR扩增. 转化力比较：将31203，△licD2在CTM培养基中增菌至A620 nm＝0.08左右，取100  μL菌液加入2 μL CPM8染色体DNA（含有红霉素抗性基因erm）和1 μL CSP, 37℃水浴90 min，系列稀释后铺于含红霉素的TSB平板（0.25 mg/L），37℃孵箱培养24～48 h后进行菌落计数，比较两者转化力差别. 最终结果以3次试验的结果的均值来进行比较.

 
　　1.2.3半定量RTPCR测定毒力因子表达将野生株和缺陷株在C+Y培养基中增菌至相同菌密度，按Qiagen Mini Kits中总RNA提取方法提取细菌总RNA. 取RNA 11 μL，随机引物1 μL，混匀后70℃变性5 min，立即置冰上. 顺序加入： 逆转录缓冲液5 μL， dNTP mix(10 mmol/L)1.5 μL，RNasin (500  mkat/L)0.5 μL，DEPC水5 μL，逆转录酶MMLV（1667 mkat/L）1  μL，混匀，37℃ 1 h，得到cDNA（最后95℃ 5 min，灭活MMLV）. 以cDNA为模板，分别扩增16 s rRNA和自溶素（major autolysin A, lytA）、链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A, pspA)、溶血素(pneumolysin, ply)和神经酰胺酶(neuraminidase, nanA) 4个毒力基因，引物序列见表1. 循环参数为： 94℃ 30s， 55℃ 30s， 72℃ 40s， 30次循环；20 g/L琼脂糖凝胶电泳.

　　1.2.4小鼠毒力实验将S.pn在C+Y培养基培养到其A620 nm＝0.498（菌密度约为4×1011  cfu/L）. 将25只BALB/c小鼠随机分为两组，其中一组13只，注射100 μL野生株菌液，含4×107 cfu；另一组12只，注射100 μL缺陷株菌液, 含4×107 cfu. 记录小鼠死亡时间，可得到半数致死时间.
 
　　1.2.5S.pn体内清除时间测定将S.pn培养于C+Y培养基中，到其A620 nm>0.5，然后用无菌PBS稀释到菌密度为5×1010 cfu/L. 将48只BALB/c小鼠随机分为两组，分别注射100 μL野生株和缺陷株菌液. 分别在注射菌液后12, 24, 36, 48 h取小鼠心脏血，每个时间段6只小鼠，系列稀释后，野生菌株血标本接种于TSA血平板，缺陷菌株血标本接种于含氯霉素TSA血平板（2.5 mg/L）. 37℃，50 mL/L CO2孵箱培养24～48 h，菌落计数，观察细菌在体内被清除情况. 最终结果以6只老鼠血液中细菌计数的平均值表示.

　　统计学处理： 数据以x±s表示，方差齐同时采用配对t检验，方差不齐时采用t′检验，P<0.05为有统计意义. 小鼠毒力实验结果采用Longrank检验，以SAS统计软件进行分析.

　　2结果

　　2.1肺炎链球菌licD2缺陷菌株的获得利用插入复制失活的方式构建licD2缺陷菌株△licD2. PCR扩增出licD2基因约310 bp，然后用XbaⅠ, Sau3AⅠ和XbaⅠ,BglⅡ分别将licD2和pEVP3进行双酶切，胶回收目的片段(图1，Marker: Gene RulerTM 1 kb DNA Ladder)，连接后转于DH5α获得重组质粒pEVP3licD2. 用HindⅢ酶切pEVP3licD2后可见大、小(约310 bp)两个片段(图2A，Marker: ФX174DNA/HinfⅠ)；以pEVP3多克隆位点两侧测序引物，PCR鉴定表明pEVP3licD2在560 bp处有目的片段，而pEVP3因没有重组licD2基因片段，扩增出的片断长度仅有250 bp(图2B). 将pEVP3licD2转化S.pn 31203，从而得到licD2基因缺陷菌株△licD2. 用licD2上游引物与pEVP3多克隆位点下游测序引物进行PCR鉴定，pEVP3licD2和△licD2由于有licD2基因片段的插入，在560 bp±均可见目的片段，而31203和pEVP3则没有该片段的产物(图3). 转化试验发现： licD2缺陷后，其转化能力与其野生菌31203相比明显下降，甚至完全消失(表2).表2S.pn 31203和△licD2转化力比较（略）

　　2.2半定量RTPCR分别测定31203和△licD2几个毒力因子的mRNA水平，结果见图4和表3. RTPCR结果显示野生菌株和缺陷菌株的毒力基因lytA(254 bp),　pspA(250 bp), ply(400 bp)和nanA(200 bp)都有一定量的表达，但△licD2的表达量较之野生菌明显下降.

　　2.3小鼠毒力野生菌株半数致死时间<1 d，而缺陷菌株半数致死时间>14 d. 两者毒力具有显著性差异（Longrank分析： χ2=43.98, P<0.001）.

　　2.4S.pn体内清除时间测定在注射野生株菌液后48 h，小鼠体内仍有较高的细菌密度，而缺陷菌在小鼠体内经36 h后大部分都已被清除，经48 h 后体内的缺陷菌几乎完全被清除, 缺陷菌的清除速度明显快于野生菌(表4). 表4S.pn在小鼠体内清除情况（略）

　　3讨论

　　基因缺失技术是目前研究基因功能的最佳方法，而插入复制失活方式是在对细菌基因功能研究中常采用的方式. 这种方式主要是利用携带有目的基因某一段序列的穿梭质粒，通过同源重组方式整合到宿主菌染色体上，从而使该基因断裂，不能产生活性产物，根据穿梭质粒上的抗性标记，就可以筛选出缺陷菌株. 这种方式简单易行，本研究就是将licD2基因的一段序列克隆到穿梭质粒上pEVP3上，再转化肺炎链球菌，从含有氯霉素的血平板上得到了缺陷菌株.
 
　　从几种毒力基因的mRNA表达来看，胆碱缺陷后几种毒力因子的表达均下降，其中不仅有CBPs类的毒力因子LytA和PspA，还有非CBPs类的毒力因子Ply和NanA. LytA使链球菌自溶从而释放出内部的各种因子，触发宿主炎症反应等［7］. PspA可减少补体在细菌表面沉积，利于细菌在体内增殖［7］. Ply是一种存在于胞质中的多功能蛋白毒素，一般认为Ply在LytA诱导细菌自溶后才被释放，能引起细胞溶解，激活补体等多种效应，其作用属于膜损伤类毒素，可造成细胞损伤［8］. NanA位于细菌表面，能清除细胞表面的多糖如黏蛋白、糖脂和糖蛋白，破坏宿主细胞的糖苷，促进细菌定植后向宿主侵袭［7］. 这些毒力因子都在S.pn致病过程中发挥着重要作用，而licD2缺陷后这些对链球菌黏附、侵袭具有重要作用的毒力因子表达量都明显下降，这可能是细菌毒力下降的原因之一.

　　从小鼠毒力实验的结果来看，licD2缺陷菌致病力显著降低，小鼠存活时间明显延长；licD2缺陷菌在小鼠体内的浓度也明显低于野生菌，说明缺陷菌在体内很快被巨噬细胞等清除，难以像野生菌一样在体内大量存活. 而S.pn引起肺炎、脑膜炎等疾病都必须先黏附于内皮细胞再侵袭进入到宿主细胞内，一旦体内存活的细菌减少，能够黏附侵袭到宿主的细菌也会相应减少，很难再进一步引发其他疾病. 这也揭示了胆碱缺陷后S.pn毒力下降的一个重要原因.

　　licD2缺陷后细菌的转化力明显下降甚至消失. S.pn的转化调控着一大批基因的表达，当进入感受态后，可启动相当量蛋白表达，同时也有大量的蛋白表达被关闭［9］. 最近的研究发现S.pn转化缺陷菌株的LytA, NanA, 透明质酸酶三种毒力因子的表达较野生菌株减弱，提示细菌的转化有利于其毒力基因的表达［10］. 这说明licD2缺陷不仅直接造成几种重要毒力因子的表达下降，还有可能通过影响S.pn的转化力来间接影响细菌毒力.
 
　　本研究结果表明licD2基因从多方面影响着细菌毒力，为从基因的角度研究胆碱在链球菌致病过程中的重要作用提供了最基本的实验依据. 而其与细菌转化的密切联系提示其可能与肺炎链球菌的条件致病相关，为进一步研究肺炎链球菌条件致病的发病机制提供了新的思路.

　　【】

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