Survivin蛋白在小鼠生精恢复过程中的表达及其与生殖细胞凋亡的关系

【关键词】  蛋白

　　Expression of survivin proteins in recovery of mice spermatogenesis and its correlation with germ cell apoptosis
HU ChuanYi

　　【Abstract】 AIM: To explore the expression of antiapoptotic proteins survivin in the testis tissue and its correlation with germ cells apoptosis. METHODS:  Adult Kunming mice were injected intraperitoneally with two doses of busulfan at 10 mg/kg bodyweight at an interval of 24 h, so as to establish the models in the process of spermatogenesis recovery. Testes were harvested in 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 weeks after the second injection. The survivin expression was detected by immunohistochemistry SP method and the germ cell apoptosis was detected by transmission electron microscope and terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique. RESULTS:  Survivin was mostly expressed in the leydig cells, secondary spermatocytes and spermatoblasts. The germ cell apoptosis mainly occurred in primary spermatocytes and round spermatoblasts. Survivin expression was negatively correlated with sperm cell apoptosis (r=-0.784, P<0.01). CONCLUSION:  Survivininduced inhibition of apoptosis may participate in the balance of apoptosis and thus plays an important role in the normal spermatogenesis.

　　【Keywords】 survivin protein; apoptosis; germ cells

　　【摘要】 目的: 探讨新的凋亡相关基因survivin蛋白在小鼠生精恢复过程中的表达及其与生殖细胞凋亡的关系. 方法: 间隔24 d两次腹腔注射白消安建立小鼠生精恢复过程的动物模型，第2次给药后随机分为1，2，3，4，6，8，10 wk 7组，于相应时间点及给药前取材，采用免疫组化SP法和透射电镜、DNA原位末端标记TUNEL法分别检测survivin蛋白的表达和细胞凋亡. 结果: Survivin蛋白主要表达于间质细胞、次级精母细胞和精子细胞，生殖细胞的凋亡主要发生于初级精母细胞和圆头精子细胞. Survivin蛋白的表达与生殖细胞凋亡指数（AI）呈负相关(r=-0.784，P<0.01). 结论: Survivin蛋白表达而引起的凋亡抑制，有利于生殖细胞凋亡稳态的维持，对正常的精子发生起重要作用.

　　【关键词】 survivin蛋白；凋亡；生殖细胞

　　0引言

　　精子发生涉及生殖细胞（germ cells, Gc）的增殖和自发性凋亡等过程，在正常的精子发生过程中，Gc的增殖和凋亡保持一定的平衡状态. Survivin是近年来分离出的凋亡抑制基因家族中的新成员，在调控细胞周期和抑制细胞凋亡中可能起重要作用. 我们通过对survivin蛋白在小鼠生精恢复过程中的表达变化及其与Gc凋亡的关系，试图阐明survivin对小鼠Gc凋亡的调控作用，以期能为男性生育的临床研究提供理论及动物实验的依据.

　　1材料和方法

　　1.1动物模型的建立和分组昆明雄性2~3 mo龄小白鼠56只（由湖北省医学研究院实验动物中心提供），体质量35~55 g，按标准饲养方法喂养. 间隔24 d两次腹腔注射白消安（德国Sigma公司产品），每次剂量为10 mg/kg，建立小鼠精子再生的动物模型. 模型建立后随机分为7组，分别为第2次用药后第1,2,3,4,6,8,10 wk组（每组8只）. 按期颈椎脱臼处死，随机取一侧睾丸组织，制作电镜样本和石蜡包埋. 石蜡标本44 μm厚连续切片，分别行survivin蛋白免疫组化和细胞凋亡检测.

　　1.2方法

　　1.2.1电镜样品的制备新鲜睾丸组织1 mm×1 mm×1 mm, 置于25 mL/L的戊二醛预固定24 h，PBS清洗后转至10 g/L的锇酸中固定2 h，逐级丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片机切片，日立H600电镜观察.

　　1.2.2免疫组化采用超高敏SP法. 一抗为兔抗人survivin pAb(1∶100)，二抗为羊抗兔IgG(1∶120)，以上抗体及SP试剂盒均购自福州迈新公司. 具体操作按说明书进行，以该公司提供的阳性片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照.

　　1.2.3检测细胞凋亡采用DNA原位末端标记(TUNEL法). TUNEL试剂盒为德国宝灵曼公司产品，检测程序参照试剂盒说明书，方法简略为：常规脱蜡入水，20 mg/L蛋白酶K 37℃消化15 min，30 mL/L H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，1∶10小牛血清封闭非特异性反应，滴加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应液，室温孵育60 min，DAB显色. 以乳腺癌标本作为阳性对照，以PBS液代替TdT反应液作为阴性对照.

　　1.2．4Survivin染色图像分析及数据处理组织切片中胞质染为黄至棕黄色者为阳性细胞标志. 每张切片随机选取5个视野，每个视野随机选取20个阳性细胞胞体，输入图像分析仪（TJY400真彩色细胞图像分析仪），对所选阳性细胞的灰度值进行测量，求出每组阳性细胞胞体的平均灰度值.

　　1.2．5凋亡细胞计数细胞核上有黄至棕色颗粒着色为阳性标志. 随机观察5~10曲细精管横断面，高倍镜(×400)下计数每个曲细精管横断面中平均阳性凋亡细胞数，其阳性细胞数的百分比为凋亡指数(apoptosis index，AI).

　　统计学处理：  采用直线相关分析(检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义).

　　2结果

　　2.1睾丸组织中survivin蛋白的表达Survivin蛋白的阳性表达定位于细胞质，胞质着色弥漫分布，呈黄至棕黄色（图1）. 小鼠睾丸组织中survivin蛋白的表达以间质细胞、次级精母细胞和精子细胞为主.

　　2.2睾丸组织中细胞凋亡情况凋亡细胞阳性定位于细胞核，在核质内或核膜下方，呈棕色，大小不一，形状各异，分布不均匀，以初级精母细胞和圆头精子细胞为主（图2）. 图3为透射电镜下观察到的凋亡的初级精母细胞.图2小鼠睾丸组织中细胞凋亡DAB ×400
图3小鼠睾丸组织中细胞凋亡(↑为凋亡的初级精母细胞)电镜图TEM ×10 000

　　2.3Survivin蛋白的表达与AI的相关性统计分析表明，小鼠睾丸组织中survivin蛋白的表达与AI呈负相关(r=-0.784，P<0.01, 图4).

　　3讨论

　　在性成熟的哺乳动物精子发生过程中，Gc不断增殖分化，产生大量的精子，维持了种代间的延续性；同时，Gc凋亡现象非常明显，以至实际精子产量比理论预期值减少75%左右. 关于Gc自发凋亡的诱导及抑制因子的本质，目前仍不清楚. 正常睾丸精原干细胞同时存在自我更新和分化成熟的过程. 白消安为一种细胞毒性药物，能杀灭各级生精细胞，而对睾丸间质细胞没有影响. 我们采用间隔24 d两次腹腔注射白消安，成功建立了小鼠生精恢复过程的动物模型［1］.

　　Survivin是一类结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)，在调控细胞周期和抑制细胞凋亡中起重要作用，主要表达于细胞的G2/M期［2］. 我们的研究表明，在小鼠生精恢复过程中，睾丸组织中survivin蛋白阳性表达以间质细胞、精母细胞和精子细胞为主；而Gc的凋亡主要以初级精母细胞和圆头精子细胞为主，与Yin等［3］的研究结果一致；survivin蛋白的表达与AI呈负相关. Survivin通过抑制Gc的自发性凋亡，从而调控Gc凋亡稳态的维持. 其作用机制可能为：①Gc胞质内survivin通过直接阻断Caspase3和Caspase7的效应、抑制多聚ADP核糖聚合酶和阻止P21等的抑制，从而抑制细胞凋亡［4］. ②精原细胞膜上可能存在较多量的survivin受体，survivin与其结合后，抑制精原细胞的凋亡. ③Gc彼此通过细胞间桥相连接，有利于细胞间survivin的沟通. ④Gc凋亡稳态的维持还需要其它信号分子协同作用、精细调节.

　　总之，survivin基因在小鼠睾丸组织的局部表达，参与了Gc凋亡稳态的维持，深入了解survivin基因对Gc凋亡的调控机制，将有助于阐明人类雄性不育的分子机制，为男性不育症及开发新的避孕药物提供理论依据.

　　【】

　　［1］ 胡传义,张茨,王则胜,等. 胶质细胞源性神经营养因子在小鼠生精恢复过程中的表达和意义［J］. 生殖与避孕， 2004,24(2):78-81.

　　［2］ Zhao J,Tenev T,Martins LM,et al. The ubiquitin proteasome pathway regulates surviving degradation in a cell cycle dependent manner［J］. J Cell Sci, 2000,113(23):4363-4371.

　　［3］ Yin Y, De Wolf WC, Morgentaler A. Experimental cryptorchidism induces testicular germ cell apoptosis by p53dependent and independent pathways in mice［J］. Biol Reprod, 1998,58(2):492-496.

　　［4］ Shin S,Sung BJ,Cho YS,et al. An antiapoptotic protein human surviving is a direct inhibitor of caspase3 and caspase7［J］. Biochemistry, 2001,40(4):1117-1123.