异基因造血干细胞移植后嵌合状态的追踪监测
【关键词】 异基因造血干细胞移植；串联重复序列；基因扩增；嵌合状态
A tracking detection on chimerism after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
【Abstract】AIM: To evaluate the chimerism after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation by analysing multiloci of short tandem repeats (STR). METHODS: Thirtyone patients who had received allogeneic hematopoietic stem cell transplantation were evaluated.Their 9 STR loci and Amelogenin gene were amplified by fluorescent multiplex PCR. PCR products were separated by using DNA Sequencer and analyzed by using GeneScan and Genotyper. RESULTS: Seven patients showed full donor chimeras at the first test, and converted into mixed chimeras at the last test; 4 of them died, and the others relapsed. Four patients blood changed from full donor chimeras to full receptor genotype. One patient changed from mixed chimeras to full donor chimeras, and he had no evidence of relapse. One patient had mixed chimerism at all times and died. Eighteen of the 31 patients had full donor chimeras at all times, and 16 of them survived leukemiafreely, but 2 died. CONCLUSION: The system of fluorescent multiplex amplification of STRs had a high power of discrimination, and this detection method is sensitive, exact and rapid. It is a valuable tool for studying the engraftment, graft rejection, and relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. At the same time, it is necessary to combine it with the clinical syndrome, and to detect STR of the patient’s blood earlier, for providing a basis for early intervention of clinical treatment.
【Keywords】 allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; tandem repeat sequences; gene amplification; chimerism
【摘要】 目的： 应用荧光标记短串联重复序列（STR）复合扩增技术，探讨多个STR基因座在异基因造血干细胞移植后嵌合体状态评估中的作用. 方法： 对31例移植后患者进行追踪检验，分别PCR复合扩增各病例组常染色体9个STR基因座和Amelogenin基因座，扩增产物经DNA自动分析仪分离后，GeneScan扫描，Genotyper分型. 结果： 7例患者血由第1次检验结果与供者STR分型一致变为混合型，4例死亡，3例复发；4例患者血由第1次检验结果与供者一致变为受者自身型，均死亡；1例患者血由混合型变为与供者STR分型一致，无复发；1例患者血两次检验均为混合型，已死亡；其余18例患者血均与供者血STR分型一致，其中16例目前预后较好，2例已死亡. 结论： 复合扩增STR基因座具有较高的个体识别力，检测灵敏、准确、快速，在对异基因造血干细胞移植患者的植入情况进行动态检测的研究中有用，对移植物植入或被排斥、疾病复发均有预警作用，同时必须结合临床症状，及时地进行STR检测，以便于早期实施临床干预.
【关键词】 异基因造血干细胞移植；串联重复序列；基因扩增；嵌合状态
0引言
异基因造血干细胞移植是通过异体的造血干细胞植入受体内而获得造血和免疫功能重建的医疗手段. 供者细胞在受者体内的形成情况及动态变化是临床预测疾病复发倾向的一项指标，因此移植后动态检测嵌合状态对判断移植效果、实施临床早期干预治疗具有重要的意义［1］. 短串联重复序列（short tandem repeat, STR）是基因组染色体上的一些简单重复序列， STR具有高度多态性和体细胞稳定性，STRPCR现已成为鉴别不同个体DNA的强有力的工具，故STR方法可用于对异基因造血干细胞移植患者的植入情况进行动态检测的研究 ［2］. 我们采用复合扩增荧光标记STR技术，对31例异基因造血干细胞移植患者的植入情况进行动态检测，评价移植后的嵌合状态.
1对象和方法
1.1对象200202/200607在北京大学人民和北京道培医院接受异基因造血干细胞移植的患者31（男19，女12）例，年龄15～52（平均32）岁. 其中，慢性粒细胞白血病6例，急性淋巴细胞白血病9例，红白血病2例，骨髓增生异常综合征2例，急性粒细胞白血病6例，急性单核细胞白血病3例，急性粒―单核细胞白血病2例，地中海贫血1例. 接受有血缘关系供者移植27例，无血缘关系供者4例. 供受体性别相合28例，性别不合3例. 主要试剂及仪器：DNA提取选用Chelex100，使用美国ABI公司ProfilerPlusTM试剂盒，扩增D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820等9个常染色体基因座和1个性别基因座. 内标ROX500及等位基因梯Ladder、上样液去离子甲酰胺（Promega公司）；DNA聚合酶（ABI公司）；3100 DNA序列分析仪和9700型PCR扩增仪（美国ABI公司）；GeneScan 3.1软件,Genotyper 2.1软件（ABI公司）.
1.2方法
1.2.1样本采集分别取供者静脉血0.5 mL、受者口腔黏膜脱落细胞、受者移植后1 mo左右静脉血1份及根据临床需要受者移植后2 mo以上的静脉血1份或多份.
1.2.2DNA提取取5 μL全血至内有1 mL去离子水的离心管中，倒转混匀10 min后，18 138 g离心3 min弃上清，加入50 g/L Chelex100 200 μL；将沾取口腔黏膜脱落细胞的棉签加入到离心管中，直接加入50 g/L Chelex100 200 μL. 56℃温育30 min，旋涡振荡，100℃加热8 min，再旋涡振荡，18 138 g离心3 min，取上清液为扩增模板DNA.
1.2.3PCR复合ProfilerPlusTM扩增反应总体积为20 μL，其中Mix 8.4 μL，引物2.0 μL，Gold Taq DNA聚合酶0.4 μL（5×106 U/L ，ABI公司），模板DNA 2.0 μL，去离子水7.2 μL，用PCR仪进行DNA扩增. 扩增热循环条件：95℃预变性11 min， 94℃变性1 min，59℃复性1 min，72℃延伸1 min，28个循环；最后60℃延伸45 min后，4℃保存备用.
1.2.4扩增产物的分离及检测将扩增产物1 μL与上样缓冲液10 μL（内含9.8 μL去离子甲酰胺和0.2 μL内标Rox500），95℃变性3 min，用DNA序列分析仪进行电泳分离与检测. GeneScan 3.1软件进行基因扫描后，利用Genotyper 2.1软件进行结果分析，以Allele Ladder为标准判读各基因座基因型.
2结果
2.1实验成功率在 31例患者中共采集了152份样本进行PCRSTR分析，均得到满意的STR分型结果.
2.2移植患者检验结果的比较7例患者血由第一次检验结果与供者STR分型一致变为混合型；4例患者血由第1次检验与供者分型一致变为受者自身型；1例患者血由混合型变为与供者STR分型一致；1例患者血检验均为混合型；其余18例患者血两次检验均与供者血STR分型一致. 31份口腔黏膜脱落细胞的分型结果，有4份为混合型.
2.3移植患者的转归7例由与供者STR分型一致变为混合型，4例死亡，3例复发；4例患者血由第1次检验结果与供者一致变为受者自身型，均死亡；1例由混合型变为与供者STR分型一致，无复发；1例患者血检验均为混合型，已死亡；2例患者虽然检验结果均与供者STR分型一致，但死亡；其余16例患者血均与供者血STR分型一致，目前预后较好.
3讨论
干细胞移植后的状态包括完全供者嵌合状态（CC，即在所分析的血细胞中，只有供者型的遗传标记存在）和混合嵌合状态（MC，有供者和受者血细胞遗传标记以一定比例共存的混合体存在）［3］. 有研究表明，移植前受者与供者外周血和口腔黏膜的DNA均不同，供者细胞植活后，受者外周血出现供者的微卫星类型，而受者的口腔黏膜细胞仍然为自己原来的类型［4］. 在本研究的第1次检验结果中，29份患者移植后血液与供者STR分型一致，达到完全供者嵌合状态. 其中4例患者口腔黏膜脱落细胞的分型结果为混合型，我们分析是由于在提取口腔黏膜的过程中混有血液细胞所致，患者黏膜细胞所表现的是其原有的DNA分型，血液细胞所表现的是现有的DNA分型，故混有血液的口腔黏膜表现为混合型.
受者细胞部分的迅速或明显增加与移植物排斥或早期复发有关［5］，本研究中，7个病例首次检验为完全供者嵌合状态，而末次检验时则为混合嵌合状态，预后均不好. 因此阶段性地使用STR监测受者可以识别出那些转变为MC的患者.
混合嵌合状态因其检测到的时期不同，供受者细胞比例的不同，意义也不同. 病例18，急性粒细胞白血病，在移植后12 d检测患者外周血为混合嵌合状态，在移植后60 d呈完全供者嵌合状态，分析其原因与OReilly等［6］的研究结果一致，他们利用微卫星的长度多态性，对骨髓移植后的患者进行嵌合状态的检测，发现移植后7～14 d可以检测到供者来源的细胞，受者细胞的逐渐消失则发生在14 d或更晚. 因此在移植后早期可检测到短暂的混合嵌合状态，以后逐渐转化为完全的供者嵌合状态. 病例10为急性淋巴细胞白血病，移植后30 d患者外周血为混合嵌合状态，移植后60 d仍为混合嵌合状态，在移植后短期内立即检测到持续存在的混合嵌合状态预示移植物的排斥反应和疾病的早期复发［7］，该患者于术后第120日死于原发病.
有18例患者多次检验均与供者血STR分型一致，其中16例目前预后较好，提示连续完全供者嵌合状态与较低的疾病发生率相关联. 病例14和17虽然取得了完全供者嵌合状态，但后来出现了复发症状并死亡. De Weger等［3］了52例骨髓移植患者，在17例复发患者中，有14例移植后早期检测只有供者STR片段，达到完全供者嵌合状态，但在临床复发前3 mo，就能检测到STRGS（gene scan）复发［8］. 病例14和17在第二次检验时尚未出现临床复发症状，故STR呈完全供者嵌合状态，患者在出现复发症状后未能及时进行STR检测. 本研究中，移植后首次检验时间一般在1 mo左右，旨在判断是否移植成功. 术后复查主要是根据临床需要，判断是否复发，术后复查时间各病例不同，以后的研究要注意确定复查时间，对可能复发的高危患者，应积极并连续地检测嵌合状态，推荐至少每月检测一次，以便及早地给予干预性. 有些STR分型显示2～4个等位基因，同时表现出供者的基因型和受者的基因型［9］，对移植后患者出现混合STR图谱进行分析，我们发现上述9个STR基因座在出现混合分型的灵敏度上无明显差异. 对混合STR图谱，在有信息的基因座上，可对供者/受者细胞比例进行定量［10］. 针对某一基因座，利用GeneScan软件得到各等位基因的峰高和峰面积值，利用公式（供者来源的等位基因峰面积总和/所有等位基因峰面积总和×100%）供者细胞成分所占百分比. 但当供/受者在某一基因座基因分型相同时，该方法存在一定的局限性.
由于STR方法无法确定混合嵌合状态中受者细胞的种类，因此在判断混合嵌合体与临床复发之间的关系时，应结合临床症状和疾病特异性指标，作出更为准确的分析.
致谢感谢西安大学医学院法医系朱波峰老师、感谢北京大学人民血研所刘代红老师和北京道培医院孙瑞娟老师的大力帮助和支持.
【】
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