大肠癌中MMP

                                     作者：郭宝文 ，李琪佳，杨琳，吴敏兰，郑宝军，阚德新

【关键词】  结直肠肿瘤；基质金属蛋白酶类；微血管密度；新生血管化,病理性；免疫组织化学

　　Expressions of MMP7, MVD in colorectal carcinoma and their correlations with metastasis

　　【Abstract】 AIM: To investigate the relationship among  matrix metalloproteinase7 (MMP7), microvessel density (MVD) and clinicopathology in colorectal carcinoma and their roles in tumor invasion and metastasis. METHODS: Immunohistochemical (SP) method was  performed to detect the expressions of MMP7 and MVD in biopsy specimens of the colorectal carcinoma (n=55) and of the healthy controls (n=20). RESULTS:  Immunohistochemical staining revealed that the positive rate of MMP7 protein was 67.3% in colorectal carcinoma and 30.0% in controls (P<0.05); the expression of MVD was 41.32±6.39 in the colorectal carcinoma and 24.17±6.23 in controls (P<0.05). There was significant difference in the expression of MMP7 between in Dukes stage A, B (65.85%) and stage C, D(92.86%) of carcinoma (P<0.05). In the meanwhile, MVD was 35.22±7.37 in stage A, B and 43.67±4.34 in stage C, D（P<0.05）. The expression of MVD in MMP7 positive group was significantly higher than that in MMP7 negative group (P<0.05). CONCLUSION:  The overpressions of MMP7 and MVD may be helpful for intratumoral angiogenesis and metastasis of colorectal carcinoma. MMP7 and MVD provide a new valuable indictor for predicting early the highrisk patients.

　　【Keywords】 colorectal neoplasms; matrix metalloproteinases;  microvessel density; neovascularization, pathologic; immunohistochemistry

　　【摘要】 目的： 探讨基质溶解素（MMP7），微血管密度(MVD)与大肠癌临床病理的关系及其在肿瘤浸润转移中的作用. 方法：  应用免疫组织化学（SP）方法检测大肠癌组织55例、正常大肠黏膜组织（对照组）20例中MMP7和MVD的表达情况. 结果： 大肠癌及对照组MMP7的表达分别为67.3%和30.0%（P<0.05）. MVD在大肠癌及对照组的表达分别为41.32±6.39, 24.17±6.23（P<0.05）. 临床Dukes分期中，A，B期组MMP7阳性表达率为65.85%，C, D期组为92.86%（P<0.05）；同时，A，B期组MVD阳性表达为35.22±7.37，C, D期组为43.67±4.34（P<0.05）. MMP7阳性大肠癌组织MVD显著高于MMP7阴性大肠癌MVD（P<0.05）. 结论： 大肠癌MMP7, MVD均呈高表达，二者具有相互促进作用即MMP7能促进结肠癌血管生成从而使血行转移速度加快；MMP7, MVD将有可能成为临床新指标检测结肠癌高危人群.
 
　　【关键词】 结直肠肿瘤；基质金属蛋白酶类；微血管密度；新生血管化，病理性；免疫组织化学

　　0引言

　　基质溶解素（matrix metalloproteinase7, MMP7）是一类较早发现的基质金属蛋白酶，由肿瘤细胞及宿主细胞如巨噬细胞、成纤维细胞分泌. 它具有强大的基质降解功能和广泛的底物活性，它的表达被认为是一种肿瘤诱导的宿主反应. 除了可促进肿瘤浸润和转移外，还可以促进原发和继发肿瘤的生长［1］. 肿瘤微血管密度（microvessel density, MVD）是近年研究肿瘤浸润转移的热点之一. 肿瘤的生长依赖于新生血管生成，同时肿瘤细胞和血管组成一个高度整合的生态系统. 我们通过免疫组织化学方法检测MMP7和MVD，探讨MMP7，MVD与大肠癌分化程度、Dukes分期之间的关系,以探讨大肠癌浸润和转移的发病机制.

　　1对象和方法

　　1.1对象标本均取自唐山工人200107/200310手术切除原发性大肠癌患者55（男34，女21）例，男女之比为1.6∶1，年龄28~80 岁，平均年龄55.5岁，术前均未接受任何抗肿瘤. 全部资料均进行了病理组织学分型及临床Dukes分期,其中管状腺癌20例，乳头状腺癌24例，黏液癌及印戒细胞癌8例，未分化癌3例. 临床Dukes分期：A期13例，B期28例，C期10例，D期4例. 另收集非肿瘤患者20（男12，女8）例，男女之比为1.5:1，年龄27~77 岁，平均年龄53.5 岁的大肠组织石蜡标本作为对照组.
MMP7和MVD（CD34）鼠抗人mAb，SP试剂盒，DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物公司.

　　1.2方法全部标本均经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋组织，切片；常规脱蜡至水，3 g/L过氧化氢孵育10 min以消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗，滴加血清工作液，室温孵育15 min（非特异性抗原封闭）；滴加一抗，4℃冰箱孵育盒中过夜. 同时用已知的乳腺癌MMP7阳性组织作阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照. PBS洗3次，滴加二抗，室温60 min，PBS洗3次. 滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温30 min，PBS洗3次，DAB显色，自来水终止，苏木素复染，封固. 阳性信号在细胞质呈棕褐色颗粒状均匀分布.

　　1.3结果判定MMP7判定标准:光镜下观片，在高倍镜视野（×400）下计数，按其阳性细胞分布范围判定,阳性细胞少于切片中肿瘤细胞的25%者判定为阴性“－”；26%~50%记为阳性“＋”；51%~75%记为阳性“”；≥76%记为阳性“”. MVD（用CD34进行标记）判断标准：采用Weidner［2］的评判标准，大肠癌间质内着色的毛细血管和微小血管. 计数方法：每张染色切片选择5个血管最多的癌间质区，在100倍视野下进行血管计数，每例标本计数5个视野，取其平均值.

　　统计学处理：  用SPSS11.5统计软件对所得数据进行成组资料t检验.
　
　　2结果

　　2.1MMP7和MVD在大肠癌组织和正常结肠组织中的表达情况MMP7在大肠癌中的表达位于癌细胞的胞质，呈棕褐色、颗粒状. 阳性细胞在癌巢中的分布是不均匀的，常位于癌巢周边区域（图1）；在对照组组织的表达位于间质血管内皮细胞，纤维母细胞、巨噬细胞胞质内. MMP7在大肠癌及对照组的阳性表达百分率分别为67.3%（37/55）及30.0%（6/20），两组间存在显著性差异（P<0.01）；MVD免疫组化染色，CD34表达位于大肠癌间质血管内皮细胞胞质，呈棕褐色颗粒（图2）. 大肠癌组及对照组CD34阳性表达分别为41.32±6.39及24.17±6.23，两组间存在显著性差异（P<0.01）.

　　图1MMP7在大肠癌中的阳性表达位于癌细胞胞质中（略）

　　图2MVD免疫组化染色，CD34阳性表达位于大肠癌间质的血管内皮细胞胞质（略）

　　2.2MMP7和MVD与大肠癌临床病理特征的关系Dukes分期中，C，D期组MMP7阳性表达率显著高于A，B期组. 黏液癌和未分化癌组MMP7阳性表达率显著高于乳头状腺癌和管状腺癌组；同时C，D期MVD阳性表达高于A，B期；黏液癌和未分化癌组MVD阳性表达高于乳头状腺癌和管状腺癌. 以上各组间比较差异均具有统计学意义（P<0.05,表1).
 
　　表1大肠癌中MMP7 , MVD与临床病理分期及分化程度的关系　略

　　2.3MMP7对大肠癌MVD的影响MVD在MMP7免疫组化阳性和MMP7阴性大肠癌组织的表达分别为43.21±5.14和37.53±6.96. 两组间比较差异有显著性（P<0.05）.

　　3.1MMP7的表达与大肠癌发生、浸润及转移的关系在大肠癌中，主要是以MMP7为主在发挥降解作用，肿瘤组织MMP7的表达增强参与了降解基底膜和细胞外基质胶原蛋白，使肿瘤细胞易于突破基底膜和细胞外基质，向邻近器官浸润，并侵入淋巴管及小血管向远处转移. 本实验显示,大肠癌的MMP7阳性表达率明显高于对照组,同时在Dukes分期中,C，D期组的表达率远高于A，B期组,证实MMP7与大肠癌的侵袭有关. 有指出MMP7在97.4%的大肠癌中表达并且随大肠癌Dukes分期的进展,MMP7的表达水平逐渐升高［3］. 由于Dukes分期可以反映大肠癌浸润转移的程度，因此MMP7的表达与大肠癌组织的侵袭性有关，这也说明MMP7在大肠癌的浸润和转移过程中可能发挥了重要作用. Hashimoto等［4］通过体外侵袭分析法发现，MMP7的分泌与活性在大肠上皮细胞的恶性转变过程中上调，证实了MMP7能促进大肠癌细胞的浸润. 同时，MMP7表达水平与大肠癌的Dukes分期有关，在发生肝转移的大肠癌中，MMP7的表达比无肝转移的大肠癌显著增高，提示MMP7表达与大肠癌的进展有关.

　　3.2MVD与大肠癌侵袭转移的关系在本研究中,大肠癌中的MVD值明显高于正常组织；Dukes C，D期的MVD表达明显高于A，B期;同时分化较低的黏液癌和未分化癌组MVD值较分化较高的乳头状腺癌和管状腺癌组表达明显高,两组比较有显著性差异（P<0.05）. 而在大肠癌中乳头状腺癌和管状腺癌较黏液癌和未分化癌分化程度好，说明大肠癌组织中的MVD值与肿瘤细胞的分化程度、侵袭转移均有一定关系，肿瘤的MVD值较高者，就有较强的侵袭能力和转移能力. 这和许多学者的研究结果相近似. Tanigawa等［5］指出,结肠直肠组织内的MVD与肿瘤细胞的分化程度、肿瘤浸润程度、淋巴转移、腹膜转移及血行转移均有一定关系，MVD值较高者，浸润和转移能力就较强. 本研究结果进一步支持此项结论.

　　3.3MMP7与大肠癌的微血管生成的关系正常条件下成熟个体很少有新生血管生成旺盛现象的发生，只有在受到损伤后的炎症修复等条件下才有可能发生. 此时也往往伴随MMP7的产生. MMP7对病理条件下血管内皮细胞的增生、毛细血管的形成具有促进作用［6］. 在本研究中，MMP7阳性组的大肠癌的MVD值明显高于MMP7阴性组，表明MMP7可能促进大肠癌的血管生成. 几乎表达过量MMP7的恶性肿瘤，其血管的生长都较丰富且和肿瘤生长同步. 关于MMP7促进肿瘤血管生成的机制，目前认为有以下两点：① MMP7降解细胞外基质，为新生血管的生长提供空间，同时，还可产生一些小分子片段，这些小分子片段作为和肿瘤血管内皮细胞表面受体相结合的细胞因子对血管内皮细胞的生长具有一定的诱导和促进作用. ② 可促进合成和释放许多调节血管生长的因子，如FGFR1，TNFa，VEGF等［7］. 这提示肿瘤细胞及基质细胞除自身分泌MMPs外，还可以通过分泌促肿瘤血管形成因子，间接促进肿瘤新生血管的形成［8］.
 
　　MMP7，MVD与大肠癌的浸润转移密切相关，二者的表达增强参与并促进了肿瘤的浸润及转移；它们将有可能作为临床上的一个新指标早期预测高危人群. 通过某种途径改变大肠癌患者体内MMP7的表达水平及抗肿瘤微血管形成来达到肿瘤的目的将成为临床上肿瘤治疗的新目标.

　　【文献】

　　［1］万远廉，潘义生，郭源，等. 人大肠癌中基质金属蛋白酶7 mRNA的表达［J］.  北京大学学报(医学版)，2001,33(1):13-16.

　　［2］Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer［J］. Am J Pathol,1995,147(1):9-19.

　　［3］Liu XP, Kawauchi S, Oga A, et al. Prognostic significance of matrix metalloproteinase7(MMP7) expression at the invasive front in gastric carcinoma［J］. Jpn J Cancer Res,2002,93(3):291-295.

　　［4］Hashimoto G, Inoki I, Fujii Y, et al. Matrix metalloproteinases cleave connective tissue growth factor and reactivate angiogenic activity of vascular endothelial growth factor 165［J］. J Biol Chem,2002,277(39):36288-36295.

　　［5］ Tanigawa N, Amaya H, Matsumura M, et al. Tumor angiogenesis and mode of metastasis in patients with colorectal cancer ［J］. Cancer Res, 1997,57(6): 1043-1046.

　　［6］ Nishizuka I, Ichikawa Y, Ishikawa T, et al. Matrilysin stimulates DNA synthesis of cultured vascular endothelial cells and induces angiogenesis in vivo［J］. Cancer Lett, 2001,173(2): 175-182.

　　［7］ Takebayashi Y, Aklyama S, Yamada K, et al. Angiogenesis as an unforrable prognostic factor in human colorectal carcinoma ［J］.Cancer, 1996,78(2):226-231.

　　［8］ Ishii Y, Nakasato Y,  Kobayashi S, et al. A study on angiogenesisrelated matrix metalloproteinase networks in primary hepatocellular carcinoma ［J］. J Exp Clin Cancer Res,2003,22(3):461-470.