针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

                        作者：秦炜炜，刘家云，张瑞，王涛，王凯，孟艳玲，杨安钢

【关键词】  乙型肝炎病毒；,RNA干扰；,腺病毒；,基因

　　Preparation of recombinant adenovirus mediated siRNA targeting HBVx gene and its suppressive effect on HBVx gene expression

　　【Abstract】  AIM: To construct the recombinant adenovirus vectors for siRNA targeting HBVx gene （HBx）  and to evaluate the inhibitive effect on the expression of HBx gene in human hepatoma HepG2 cell line. METHODS: The shuttle vector pShuttleHBx was cotransfected into E. coli BJ5183 with adenovirus backbone plasmid. The  homologous recombinants were transfected into HEK293 packaging cells and adenovirus was packaged and amplified, followed by infection of the HepG2 cells transfected with HBx gene. The expression levels of HBx were determined by RTPCR and Western Blot after the total RNA and protein were collected.  RESULTS: The recombinant adenoviral vectors containing siRNA targeting HBx gene were successfully constructed, which were confirmed by restriction enzyme digestion. RTPCR results demonstrated that the HBx mRNA was markedly decreased and Western Blot results showed that the expression of HBx protein was also significantly reduced in HepG2 cell line. CONCLUSION: Adenovirusbased siRNA targeting HBx gene can inhibit HBx expression with great potency and specificity in vitro.

　　【Keywords】 hepatitis B virus; RNA interference; adenovirus; gene therapy

　　【摘要】 目的：构建针对乙型肝炎病毒x基因（HBx基因）的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体，并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用. 方法：重组腺病毒穿梭载体pShuttleHBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体，后者转染HEK293细胞，包装并扩增出病毒颗粒. 用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2，收集细胞总RNA和总蛋白，采用RTPCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化. 结果：经限制性内切酶酶切鉴定，证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功. RTPCR和Western Blot方法证实，在HepG2细胞中，HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低. 结论：腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.

　　【关键词】 乙型肝炎病毒；RNA干扰；腺病毒；基因治疗

　　0　引言

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因组中，HBx基因编码的HBX蛋白是HBV编码蛋白中唯一具有多种调控功能的病毒蛋白质［1-2］，可以激活宿主细胞中受损DNA的修复［3-4］，并且同多种肿瘤相关分子有相互作用. 因此认为，HBX与肝细胞肝癌的发生和密切相关. RNA干扰(RNA interference, RNAi)是双链RNA (doublestrand RNA, dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）现象，其主要生物学功能在于抵抗病毒感染，维持基因组中转座子的稳定性，清除异常RNA，并参与基因表达的调控［5-6］. 我们构建针对HBx基因重组腺病毒干涉载体，在人肝癌细胞株HepG2中检测其对HBx基因表达的抑制效果，为乙型肝炎病毒感染以及感染后发生的肝细胞肝癌的基因治疗提供新思路.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　含有针对HBx基因的两个干涉靶序列的干涉表达质粒pSUPERHBx2，pSUPERHBx5（干涉序列分别针对HBx基因的301~319位和198~216位），表达HBx基因的质粒pCNDA3.1HBxmyc，对照载体AdeasyH1，pCDNA3EGFP，大肠埃希菌DH5α，HEK293细胞以及人肝癌细胞HepG2（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）. pAdeasy1腺病毒重组系统（Stratgene公司）；限制性内切酶Xba I，Hind III和T4 DNA连接酶（ TaKaRa公司）；限制性内切酶Pac I和Pme I（New England Biolab公司）；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HDMEM培养基和RPMI 1640培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；LipofectAmineTM2000，RTPCR试剂盒和TRIZOLTM试剂（Invitrogen公司）； myc标签, EGFP多克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔抗人βactin多克隆抗体和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗（武汉博士德公司）；ECL化学发光试剂盒为（Pierce公司）. 用于扩增HBx基因的上游引物：5′TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3′，下游引物：5′TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′；用于扩增内参照βactin基因的上游引物: 5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′, 下游引物: 5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′；用于扩增EGFP基因的上游引物：5′ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3′， 下游引物：5′GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3′,上述引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的构建

　　经Xba I和Hind III双酶切反应，从pSUPERHBx2，pSUPERHBx5质粒获取RNAi表达框片断HBx2和HBx5（大小300 bp左右），将两目的片断回收后亚克隆入同样经Xba I和Hind III双酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用Xba I和Hind III双酶切，10 mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 获得含小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.

　　1.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5载体的构建

　　将pShuttleHBx2，pShuttleHBx5质粒用Pme I酶切线性化，与pAdeasy1按10∶1的比例电转化至BJ5183感受态细菌. 卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取较小的克隆扩增培养，提取质粒. 用Pme I酶切鉴定质粒，将鉴定正确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞，扩增阳性克隆并大量提取质粒，得到含针对HBx干涉表达框的重组腺病毒质粒. （阴性对照质粒AdeasyH1为带有H1启动子的pAdShuttle质粒，用Pme I酶切线性化后与pAdeasy同源重组得到）.

　　1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定

　　①包装细胞培养：含100 mL/L胎牛血清的HDMEM培养基，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养HEK293细胞，当细胞汇合度达70%~80%时转染.  ②重组腺病毒质粒转染HEK293细胞：重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用Pac I酶切线性化后回收，按照LipofectAmineTM2000说明书转染6孔培养板中的HEK293细胞，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，10~12 d后收集细胞，液氮与37 ℃两个温度下反复冻融4次，裂解细胞以收获原始病毒，病毒感染HEK293细胞使病毒大量扩增. 重复上述步骤，最终收集3轮扩增的病毒液，分装保存于-70℃. ③病毒滴度的测定：用 TCID法检测病毒滴度后，得到1×1010 pfu/mL的病毒工作液.

　　1.2.4RTPCR检测

　　重组腺病毒对HBx基因mRNA的降解作用制备的重组腺病毒感染人肝癌细胞株HepG2，同时转染表达HBx基因的质粒pCNDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP，后者用来监测各组转染效率，对照组转染只含有H1启动子的质粒AdeasyH1. 37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48  h后，分别收集细胞总RNA和蛋白. 通过RTPCR检测HepG2细胞HBx转录水平的变化：提取实验组和对照组HepG2细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，取5 μg总RNA按照SuperScriptTM Ⅱ说明书进行cDNA第一链的合成 ，以反转录得到的cDNA为模板在PE2400型DNA扩增仪上进行PCR反应. HBx PCR条件为：95℃变性5 min，再95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min. 反应产物为HBx基因片段，长度为464 bp；内参照βactin基因扩增条件为：95℃变性3 min后，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共20个循环，最后72℃延伸5 min，扩增片断大小为438 bp；EGFP基因PCR反应参数为：95℃变性5 min，再95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，共27个循环，最后72℃延伸5 min，反应产物为538 bp. 10 mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，比较干涉组与对照组mRNA水平表达差异.

　　1.2.5Western Blot检测

　　重组腺病毒对HBX蛋白表达的影响用100 μL的细胞裂解液裂解上述各组细胞，4℃ 10 000 g离心20 min，收集上清液，加入等量2×SDS Loading Buffer， 煮沸5 min, 每孔上样30 μL， 蛋白样品经SDSPAGE分离后， 电转移到硝酸纤维素膜上. 依次加入5 g/L脱脂奶粉（室温封闭2 h）， 1∶200 myc标签抗体和EGFP抗体（室温孵育2 h）， 1∶2000的HRP酶标羊抗兔二抗（室温孵育1 h）. 用TBST缓冲液洗涤后，加入底物发光剂ECL 1 mL，反应5 min后吸干发光剂，用单层透明薄膜包裹后曝光,X光胶片显影.

　　2　结果

　　2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的鉴定

　　用Xba I和Hind III双酶切构建的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5，得到6300 bp及300 bp左右的片断（图1），与预期大小一致,证明穿梭质粒构建成功.

　　2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5载体的鉴定

　　用Pme I分别酶切重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5，得到23 000 bp和4300 bp两个片断（图2），结果与预期一致，证明骨架质粒同源重组成功.

　　2.3重组

　　pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5腺病毒的包装含重组腺病毒的质粒转染包装细胞HEK293，培养1 wk后，显微镜下可见特征性圆球状及葡萄串样聚合的细胞病理性改变；电镜下可见病毒感染后的死细胞，胞体肿胀，胞膜不完整，细胞内充满病毒颗粒（图3A，图中箭头所示即为病毒颗粒）, 以及感染细胞的胞核，内有成堆的病毒颗粒（图3B，图中箭头所示为病毒颗粒）. 第10日，可见大部分包装细胞肿胀脱落，细胞出现细胞病理反应（cytopathological effect，CPE）样变化.
A： 病毒感染的包装细胞 ×4000； B： 包装细胞胞质内的病毒颗粒 ×40 000.

　　2.4共转HepG2细胞观察HBx基因表达情况

　　包装完成的病毒颗粒以30 MOI感染人肝癌细胞株HepG2，48 h后，分别收集细胞总RNA和蛋白，检测其变化. RTPCR结果表明，与未处理组和转染空载体组细胞相比，感染腺病毒组细胞的HBx基因mRNA量明显降低（图4A）；Western Blot结果显示，感染腺病毒可使细胞HBX蛋白的表达量显著减少（图4B）.

　　3　讨论

　　目前，在我国广泛应用的抗HBV药物主要有两类，即α干扰素和核苷类药物如拉米夫定等. 但疗效均不理想，新型有效的抗HBV药物仍在探索中. RNAi用于HBV在理论上具有以下优点［7］：特异性降解HBV mRNA，从而阻止病毒复制，对已整合入宿主细胞基因组的前病毒及无复制活性的病毒，RNAi也可以起到有效的抑制作用，这是通常抗病毒药无可比拟的. 其次，RNAi可以针对病毒基因保守区发挥作用，从而限制病毒产生逃避突变株的能力. 因而，RNAi技术为各类慢性HBV感染开辟了新的途径. 有学者认为RNAi技术应用于抗HBV治疗，有望成为治疗乙型肝炎的革命性新方法，将有巨大的社会价值［8］. 腺病毒载体是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一. 由于腺病毒载体宿主范围广，感染效率高，可插入外源基因片段大，可介导外源基因短时呈高水平表达和不整合到感染细胞的基因组中等特点［9］.
　　
　　在本实验中，我们采用He等［10］创建的pAdeasy腺病毒载体系统，通过细菌体内同源重组的方法，构建针对HBVx基因的两个不同位点的siRNA重组腺病毒载体. 该方法不但发挥了重组腺病毒高效、安全等优点，同时，还具有重组效率高，包装时间短等特点. 腺病毒载体介导的RNA干扰克服了以往用质粒作为siRNA输送载体转染效率低的缺陷.

　　实验中我们使用RTPCR, Western Blot的方法在mRNA水平和蛋白质水平证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒有效地抑制了HBx基因的表达.
本实验表明腺病毒是一种有应用前景的抗HBV感染的基因治疗载体， 其可为慢性HBV感染以及HBV感染后发生的肝细胞肝癌的基因治疗提供新思路.

　　【】

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