普伐他汀对中枢神经系统缺血损伤后神经发生的影响

【摘要】  　　目的： 研究普伐他汀对中枢神经系统缺血损伤后神经发生的作用. 方法： 采用线栓法造成大鼠大脑中动脉的暂时性缺血，并在伤后以下时间点给予普伐他汀：伤后6 h，以及伤后每天至伤后14 d. 并通过旋转实验评价伤后神经学恢复情况. 此外还通过三染色法(BrdU, DCX, NeuN)研究了他汀类药物对中枢神经系统损伤后神经发生的作用. 结果： 相对于对照组，实验组动物术后旋转实验评分显著性增加；普伐他汀显著增加了齿状回和脑室下区的BrdU阳性细胞数，并增加了齿状回、脑室下区和纹状体中的BrdU/DCX阳性细胞数. 结论： 中枢神经系统损伤早期重复使用低剂量的普伐他汀是相对安全的，并能够显著改善伤后的神经功能恢复. 普伐他汀能够诱导大鼠齿状回及脑室下区的神经发生并增加纹状体中迁移神经元的数量.

【关键词】  缺血 普伐他丁 神经发生

     0引言

    普伐他汀具有一定的神经保护功能，并可促进新生血管的生成.  但其对中枢神经细胞的再生和迁移作用鲜有报道. 本试验我们主要观察了普伐他汀在大鼠中枢神经缺血损伤后的神经保护和神经发生作用.

    1材料和方法

    1.1材料成年Wister大鼠45只，体质量270~330 g，饲养于昼夜时间为12： 12 h的恒温饲养室内，水和食物自由摄取. 应用由10 mL/L的氟烷、700 mL/L的二氧化氮和300 mL/L的氧气组成的混合气体麻醉试验动物，采用线拴方法诱导60 min大鼠的大脑中动脉栓塞［1］，随后进行再灌注. 整个试验过程中动物的体温被控制在(37±0.5)℃，并监测 血压、心率、血气分析等.

    1.2方法

    1.2.1试验分组除试验过程中死亡5只外，剩余40只实验动物被随机分成4组，每组10只：大鼠接受大脑中动脉栓塞或者假手术，每组动物接受1 mg/kg的普伐他汀或者等量的生理盐水腹腔注射. 药物注射时间点为： 术后6  h、以及随后14 d的每一天.  此外，每只大鼠术后每天腹腔注射100 mg/kg的溴脱氧尿核苷（BrdU）.

    1.2.2行为学测试旋转试验被用来进行行为学测试. 大鼠被置于一个加速的旋转轴装置上，旋转速度在5 min内从4 r/min加速到40 r/min. 当大鼠从装置上坠落或者仅抓附于旋转轴2转以上并且未尝试行走则被判断为试验结束. 最长行走时间限定于500 s. 每个时间点进行3次测试并取其平均值作为该时间点的持续时间［2］.

    1.2.3免疫荧光组织化学于术后14 d，取大鼠脑组织进行普通石蜡包埋并切片，厚度为1 μm. 经二甲苯进行脱蜡，乙醇脱水后，用3 mL/L过氧化氢?甲醇溶液消除内生过氧化物酶活性. 加入第一抗体：大鼠抗?BrdU (1∶100,Oxford Biotechnology Ltd, UK),  小鼠抗?NeuN (1∶200, Chemicon, Temecula, CA), 羊抗?Doublecortin(DCX) (1∶50, Santa Cruz, USA)，4℃反应48 h，TBS冲洗3次；加入第二抗体：交联Cy2的抗大鼠抗体 (1∶200, Jackson Immunoresearch Laboratories, USA), 交联ROX的抗小鼠抗体 (1∶200, Jackson), 交联Cy5的抗羊抗体 (1∶200, Jackson)，37℃反应2 h, TBS冲洗3次后盖玻片封片.

    1.2.4细胞计数组织切片采用配有Dage MTI数码相机的荧光显微镜(×40物镜，Leica, DMR, Germany)进行扫描. 全部图像采用MCID机成像分析系统(MCID ELITE 7.0, Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Canada)收集. 分别对大脑患侧齿状回（DG）、室下区（SVZ）和纹状体进行BrdU阳性细胞和DCX阳性细胞计数. 每个大脑共计两个层面，每个层面计4个视野. 分别获取每个层面的BrdU阳性细胞数和BrdU/DCX阳性细胞数.

    统计学处理： 数据分析采用StatView(SAS Institute Inc., USA, 1998)统计软件，行方差分析和独立t检验，并应用F检验进一步确定组间的显著性差异. 显著性水平为0.05，所有数据表示为x±s.

    2结果

    共使用实验动物45只，5只在14 d内死亡，40只动物存活至实验完成，每组10只. 1只大鼠在24 h内死亡，4只大鼠在14 d内死亡，死亡原因为脑出血. 死亡率分布如下：普伐他汀手术组3只，对照手术组2只. 组间死亡率无统计学差异. 亦未发现组间实验动物生理指标pH, PaCO2, PaO2, BP等的统计学差异.

    行为学测试显示，术后第5日和第7日普伐他汀手术组和对照手术组之间无统计学差异；至术后第14日，普伐他汀手术组动物的旋转试验得分则高于对照手术组［(422±21) s vs (336±17) s, P=0.0216］.

    相对于对照组，普伐他汀手术组脑组织中的BrdU阳性细胞在患侧的齿状回(图1，表1，P=0.0029)和室下区(图2， 表1，P=0.0280)中都有显著性增加，但在纹状体中(图3，表1， P=0.3929)未发现显著性差异（表1）. 通过三重染色，我们发现普伐他汀手术组动物的BrdU标记的DCX阳性细胞(BrdU+/DCX+)在患侧的齿状回(图1，表1，P=0.0031)、室下区(图2，表1，P=0.0316)和纹状体(图3，表1，P=0.0073)中有显著性增加. 所有切片中未发现BrdU+/NeuN+细胞，只在普伐他汀手术组动物大脑齿状回中发现非常少量的BrdU+/NeuN+/DCX+细胞(图1箭头所示). 值得注意的是，在1只普伐他汀手术组大鼠的脑组织切片中发现了一条从室下区到纹状体的DCX阳性细胞带. 这一发现提示了一条可能的未成熟神经元的迁移路径. 表1齿状回、室下区、纹状体细胞计数

    3讨论

　　在本研究中，我们证明了在大脑缺血性损伤后急性期内重复使用普伐他汀可以诱导大脑患侧齿状回和室下区的细胞增殖，并显著性的增加纹状体内迁移细胞数量. 同时普伐他汀可以改善大脑缺血性损伤后的功能恢复.

　　齿状回和室下区作为神经发生区域已经被广泛接受. 我们使用了一种鸡尾酒三染色方法研究大鼠大脑缺血损伤后的细胞增殖情况. ① BrdU为细胞分裂S期的标记物，它被用于评估大脑缺血损伤后的新生细胞数；② DCX被用于分析未成熟细胞和迁移细胞；③ NeuN被用于评估神经元的成熟和分化.  本研究中，普伐他汀可以显著增加脑损伤侧齿状回和室下区的BrdU+和BrdU+/DCX+细胞数. 而在假手术组中未观察到类似现象. 因此普伐他汀可以促进大鼠中枢神经缺血性损伤后的神经发生. 我们同样观察到普伐他汀可以显著增加纹状体内BrdU+/DCX+细胞数而非BrdU+细胞数. 这意味着普伐他汀可图1齿状回中的细胞增殖. 图A到D显示了实验组动物脑损伤半球的细胞增殖，箭头所指为一个BrdU+/DCX+/NeuN+细胞. 图E到H显示了对照组的细胞增殖.

    图2室下区的新生神经细胞. 普伐他汀组（A到D箭头所示）的BrdU和DCX阳性细胞数明显多于对照组（E到H箭头所示）. 图I中可见从室下区到纹状体的DCX阳性细胞带.

    图3纹状体中的新生神经细胞. 实验组（A到D箭头所示）脑损伤侧的BrdU+/DCX+细胞数明显多于对照组（E到H箭头所示）.

　　能促进了非成熟神经元的前体细胞从室下区到纹状体的迁移，但没有观察到促进纹状体内细胞增殖的功能. 另外有少量的BrdU+/NeuN+/DCX+ 细胞可见于普伐他汀手术组的齿状回中，意味着普伐他汀可能具有促进新生神经元的成熟和分化的作用. 从细胞计数结果中还可以看出作为细胞增殖区，脑损伤后室下区比齿状回增殖更加活跃. 这种他汀类药物诱导的神经发生可能是因为神经元前体细胞的增殖［3］. 部分实验显示他汀类药物可以通过磷酸激酶途径调节干细胞的分化并增加前体细胞的数量［4］.

　　研究表明长期的他汀类药物预防性使用可以增加内皮二氧化氮合酶（eNOS）在脉管系统和血小板中的表达，增加大脑血流量，减少脑损伤面积并改善伤后的功能恢复［5］. 除此之外，他汀类药物在脑损伤之后应用的效果也相继被报道［6］：低浓度的普伐他汀可以促进内皮细胞的增殖、迁移和分化；低浓度的阿伐他汀（1 mg/kg）可以改善大鼠脑损伤后的神经功能恢复. 我们的研究表明低浓度的普伐他汀（1 mg/kg）可以促进成年大鼠大脑缺血性损伤后的神经发生，这种神经发生远大于条件下由脑缺血所诱导的神经发生.

　　他汀类药物有一些非常严重的副作用. 本实验中，组间并未发现死亡率的统计学差异；在旋转试验中，也未发现假手术组中普伐他汀组和生理盐水对照组之间有运动功能的统计学差异. 这表明短期内低剂量普伐他汀的重复使用是相对安全的，并未造成实验动物运动功能的损害.

【】
  ［1］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989,20:84-91.

［2］ Schabitz WR, Berger C, Kollmar R, et al. Effect of brain?derived neurotrophic factor treatment and forced arm use on functional motor recovery after small cortical ischemia［J］. Stroke, 2004,35:992-997.

［3］ Chen J, Zhang ZG, Li Y, et al. Statins induce angiogenesis, neurogenesis, and synaptogenesis after stroke［J］. Ann Neurol, 2003,53:743-751.

［4］ Werner N, Priller J, Laufs U, et al. Bone marrow?derived progenitor cells modulate vascular reendothelialization and neointimal formation: Effect of 3?hydroxy?3?methylglutaryl coenzyme a reductase inhibition［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2002,22:1567-1572.

［5］ Amin?Hanjani S, Stagliano NE, Yamada M, et al. Mevastatin, an hmg?coa reductase inhibitor, reduces stroke damage and upregulates endothelial nitric oxide synthase in mice［J］. Stroke, 2001,32:980-986.

［6］ Sironi L, Cimino M, Guerrini U, et al. Treatment with statins after induction of focal ischemia in rats reduces the extent of brain damage［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003,23:322-327.