分枝杆菌计数方法的比较研究
【关键词】 紫外分光光度计法；湿重法；平板菌落计数法；标准曲线；牡牛分枝杆菌
Comparative study of Mycobacterium counting methods
【Abstract】 AIM: To build up a fast counting method for Mycobacterium vaccae (M. vaccae). METHODS: We counted M. vaccae by UV spectrophotometry, wet weight measurement and plate count method, and built up two standard curves. One was drawn according to the results of UV spectrophotometry to plate count and the other was humid weight to plate count. RESULTS: We built up two standard curves with the results of UV spectrophotometry and wet weight, to plate count, respectively. The analysis of accuracy rating proved that there was an approximal linear correlation between the two standard curves ranging from 105/mL to 108/mL. CONCLUSION: The method is dependable, and can be used for quick counting of M. vaccae.
【Keywords】 UV spectrophotometry; wet weight measurement; plate count; standard curve; Mycobacterium vaccae
【摘要】 目的： 建立牡牛分枝杆菌的快速检测方法. 方法： 采用紫外分光光度计法、测湿重法、平板菌落计数法测定细菌数，建立紫外分光光度计法、测湿重法对平板菌落计数法的标准曲线. 结果： 建立了紫外分光光度计法和湿重法相对于平板计数法的标准曲线，通过准确度分析表明在细菌含量在每毫升105～108之间时，两标准曲线线性关系良好. 结论： 该方法可用于牡牛分枝杆菌的快速计数.
【关键词】 紫外分光光度计法；湿重法；平板菌落计数法；标准曲线；牡牛分枝杆菌
0引言
结核病目前仍是严重危及全球的公共卫生问题之一. 据世界卫生组织估计［1］，当前全球约有20亿人受结核分枝杆菌感染，我国近5亿人感染. 因此，结核病的研究已成为传染病研究的热点之一. 在科研工作中，如进行转化、毒株攻击等时，需要即时检测细菌的浓度范围. 但分支杆菌的生长较慢，用普通的平板计数法进行计数，不能满足时效性. 因此，找到一种快速计数分支杆菌的方法，将为科研提供极大便利. 牡牛分支杆菌是一种快速生长型分支杆菌，广泛应用于结核病的发病机理和疫苗研究中. 本文研究紫外分光光度法、测湿重法和平板计数法间的关系，绘制紫外分光光度计法和测湿重法标准曲线，建立能快速计数的方法.
1材料和方法
1.1材料紫外分光光度仪（JENWAY 6405 UV/Uis Spectorophotometer）、天平，离心机（eppendorf centrifuge 5415 D）, 牡牛分枝杆菌（由微生物教研室保存）；LB培养基，每200 mL含NaCl 2 g、营养粉2 g、酵母提取物2 g，固体培养基加入琼脂粉3.5 g；7H9培养基（DIFCO）.
1.2方法
1.2.1紫外分光光度计法测吸光度用接种环在从分枝杆菌菌种中取一环菌，接种到5 mL LB培养基中. 置于37℃摇床中振荡培养约24 h，使细菌活化. 测吸光度值，当吸光度值＞0.6时将细菌按1∶100的比例转接到200 mL LB培养基中扩大培养，置于37℃摇床中振荡培养. 每隔3 h在超净工作台中用无菌移液枪从培养基中吸取5 mL菌液，于无菌短中管中，其余菌液放入摇床中继续培养. 用1 mL一次性注射器将短中管中菌液反复吹打，充分重悬，使聚集生长的细菌充分混匀. 取6个5 mL离心管，每管加入去离子水2 mL分别标记1～6待用. 从混匀后的菌液中取1 mL，用离心机离心，11 000 g, 1 min，收集菌体沉淀. 去上清，再次离心，充分除去培养液. 用2 mL去离子水重悬，以去除LB培养基对吸光度值的影响. 按倍比稀释法，将菌液进行稀释，得到6个稀释度. 细菌稀释倍数依次为2-1到2-6. 用去离子水做对照，依次对10个离心管中的菌液测吸光度值.
1.2.2用电子天平称细菌湿重按上述方法将细菌扩大培养. 1 mL一次性注射器将菌液反复吹打，充分重悬，使成团生长的细菌充分混匀. 取12支离心管，分别编号1～12，于电子天平上精确称重，准确记录各管重量. 将离心管分成3组，分别为1～4号、5～8号、9～12号. 第1组每管称量菌液0.5 mL，第2组吸1.0 mL，第3组吸1.5 mL. 离心，11 000 g， 1 min. 去上清，吸干培养基，再次离心，直到较好的去除培养基. 将收集了细菌的离心管于电子天平上准确称重，记录重量. 用第二次重量减去第一次重量所得差值即为湿重. 将各湿重除以各管所吸取菌液体积，即得每毫升菌液的细菌湿重，取平均值，即为每毫升菌液所含细菌湿重.
1.2.3平板菌落计数法测活菌浓度按上述方法将细菌扩大培养. 每隔3 h在超净工作台中用无菌移液枪从培养基中吸取5mL菌液，于无菌短中管中，其余菌液放入摇床中继续培养. 用1 mL一次性注射器将短中管中菌液反复吹打，充分重悬，使成团生长的细菌充分混匀. 按十倍递增稀释至10-3~10-7. 取15块LB平板培养基，分别从每个稀释度的菌液中，取200 μL，用平板涂布法，涂于平板中，标明稀释度，每个稀释度涂3块平板. 37℃培养箱培养72 h后，可见菌落形成，选取菌落数在30~300间的平板进行计数，每组稀释度相同的平板取平均值作为菌落数. 出原菌液细菌浓度，作为细菌菌液的标准浓度.
2结果
2.1吸光度与活菌浓度的关系本实验要确定溶质浓度即分枝杆菌浓度，与分枝杆菌液体在波长600 nm处的吸光度值的关系. 根据朗伯比尔定律［2］： A=EcL, A为吸光度值, E为吸光常数，即厚度为1 cm，溶质浓度为1%（mol/mL）时的吸光度值、L为光程，即光线通过液体的长度（比色杯厚度）, c为液体的浓度（mol/mL），本实验中E为定值， L为比色杯厚度为1 cm. 因此，吸光度值A与浓度c成正比关系，斜率为EL. 得出E值，即可得牡牛分枝杆菌菌液吸光度值与浓度的关系式. 在一般科研中，所用分枝杆菌菌液为对数生长期时的菌液. 处于此期的细菌，活菌量远大于死菌量，故可近似认为菌液的浓度即为活菌浓度.
对同一菌液同时测吸光度值与进行平板菌落计数，将平板菌落计数所得菌液浓度作为细菌标准浓度c. 根据所测出A值以及相对应的标准浓度c值，通过公式A=EcL可算出E值. 重复测量，得出多组E值，取平均值即为最终E值. 本试验测出E值为2.73×10-9.
由上所得E值，可得吸光度与活菌浓度关系式为A=2.73×10-9×c . 由于斜率过小，不方便作图，因此，将浓度c进行数学变换，以方便作图. 令x=lgc，y=A，则y=2.73×10-9×10x（图1）.
图1吸光度与细菌浓度对数的关系 略
2.2湿重与活菌浓度的关系从理论上讲，细菌湿重=单个菌重量×（活菌量+死菌量）＋未除尽液体重量. 在离心收集细菌的时候，尽量除净液体，并采用相同的操作步骤，使所含微量液体尽量相同，则可近似认为湿重与活菌量成线性关系，即湿重=单个菌重量×活菌量. 根据所测湿重及活菌量，算出单个分枝杆菌的重量. 本试验测出的单个菌重量为8.64×10-12 g. 所得关系式为M=8.64×10-12×c. M（g/mL）为单位体积菌液的湿重，c（mol/mL）为菌液浓度. 由于斜率过小，不方便作图，故将浓度c进行数学变换，以方便绘制图. 令x=lgc，y=M，则得到y关于x的方程为y=8.64×10-12×10x （图2）.
图2湿质量与细菌浓度对数值的关系 略
2.3紫外分光光度计法准确度的测定准确度可用相对误差表示. 按照制备标准曲线的方法制成分枝杆菌菌液. 由标准曲线方程测定值，重复5次，求出5次测定值的相对误差. 相对误差不大于5%，可认为准确.
表1紫外分光光度计法的准确度 略
2.4 两标准曲线用于绘制分支杆菌生长曲线为了进一步检验紫外分光光度计法和湿重法的可行性，我们用这两种方法分别绘制牡牛分枝杆菌的生长曲线. 同时也用平板菌落计数法绘制生长曲线，作为标准曲线，与前述两曲线进行对比，来判断可行性.
按紫外分光光度计法所述方法，对牡牛分枝杆菌进行扩大培养，体积为200 mL. 每隔3 h取一次菌液，分别测量A600值及单位体积的湿重，运用标准曲线，计算出菌液在不同时间点上的浓度. 同时用平板菌落计数法，测量每一时刻的菌液浓度，作为菌液的标准浓度. 将所得所有浓度用图1所示公式，全部转换成吸光度值，再分别绘制图形（图3）. 从图上可看出，运用标准曲线所得结果与用平板菌落计数法所得标准浓度，相差不大，可用于对浓度精度要求不高的科研实验中.
图3紫外分光光度计法、湿质量法和平板计数法绘制的生长曲线 略
3讨论
关于分枝杆菌活菌量快速检测的方法研究，在国内外均有很大进展，方法亦有很多，如：BACTEC快速检出和非放射自动化分析系统［3］，生物发光法、流式细胞仪检测［4］，荧光素酶报告噬菌体技术ILRP［5］，核酸体外扩增法等等［6-7］. 他们均用于快速检测细菌的浓度，但有些方法如非放射自动化分析系统、流式细胞仪检测等，投入太大，仪器设备价格太高；有些方法如核酸体外扩增法等，操作比较复杂，需要专门的设备和技术. 在用分枝杆菌做载体的研究中，经常需要即时了解细菌的浓度范围，这就要求建立用现有方法即时测定细菌活菌浓度的标准. 本文用紫外分光光度法和湿重法，建立了标准曲线和直线的公式，经验证实验表明准确度较高. 用该公式进行测定，表明和金标准的误差不大，可以根据实际实验要求选择其中一种或联合使用.
通过多次的转接培养之后，分枝杆菌活力旺盛，再培养时，保证充足的营养物质，则细菌在进入平台期之前，细菌活菌量远大于死菌量，从而可以忽略不计死菌量，认为细菌的活菌浓度等于细菌浓度. 故可认为吸光度值和细菌活菌浓度之间，以及湿重和活菌浓度之间为正比关系. 以平板计数法为基础，得出吸光度值、湿重分别与平板计数所得活菌浓度的关系，绘制标准曲线. 由于分支杆菌聚集生长的特性，在测量吸光度以及在用平板计数法测浓度之前，必须先将聚集的细菌悬浮，以免对测量结果造成较大误差. 本实验根据，采用小孔径注射器充分的吹打菌液［8］，再用振荡器振荡使细菌充分重悬. 进行测量时设置重复对照组，将所得结果取平均值作为最后结果，可提高准确度. 由于仪器的灵敏度以及细菌的生长特性，所得标准曲线在浓度为106～109间较准确. 浓度太低，则紫外分光光度计测量值偏大，使得浓度偏高；天平则很难测出湿重，无法进行计数. 因此，本实验主要根据对数期和稳定期的细菌计数，对于陈旧培养物的测定，还需要结合其他的计数方法.
【文献】
［1］ 潘希，何国均. 耐多药结核病的研究及进展［J］. 中华结核与呼吸杂志，2000,23（2）:119-123.
［2］ 郝勇. 朗伯比尔定律在定量计算中的活用［J］. 数理医药学杂志，1996,9（4）:383-384.
［3］ Bandak F，Kiaka DL，Setterqutst S，et al. Comparison or Mycobacteria growth indicator tube with BACTEC 460 for detectria and recovery of Mycobacteria from clinical specimens［J］. J Clin Microboil, 1996,34:2 236-2 239.
［4］ 唐国华，何淑雅，贺修胜. 流式细胞仪每秒进样细胞数对细胞G0/G1期峰的荧光强度值及变异系数值的影响［J］. 中华病杂志，2005，34（12）：816-817.
［5］ 刘纯杰，王德文. TGFβ1反义基因及表光荧光素酶的重组腺病毒对放射性肺纤维化体内基因初探［J］. 中华放射医学与防护杂志，2001，21（4）：282-285.
［6］ 陈庆山，刘春燕，刘迎雪，等. 核酸体外扩增技术［J］. 生物工程杂志， 2004,24（5）:10-14.
［7］ 陆宇，朱莉贞，段连山. 结核分枝杆菌活菌检测方法及应用［J］. 结核病与胸部肿瘤，2005,1 :66-71.
［8］ Mariani F, Cappelli G, Riccardi G, et al . Mycobacterium tuberculosis H37Rv comparative geneexpression analysis in synthetic medium and human macrophage［J］. Gene, 253 (2000):281-291.
柏银兰，薛莹
