镉致腺垂体-肾上腺皮质凋亡机制研究

【摘要】  目的 观察CdCl2作用后腺垂体?肾上腺皮质系统凋亡情况及半胱天冬酶?9的表达变化。方法 48只雄性SD大鼠随机分为4组，即对照组、CdCl2低剂量组(1?0mg／kg)、中剂量组(2?0mg／kg)、高剂量组(4?0mg／kg)。经口灌胃染毒，每周5d，连续6周。染毒结束后分离腺垂体和肾上腺皮质进行透射电镜观察、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡、半胱天冬酶原?9mRNA(procaspase?9mRNA)表达、半胱天冬酶?9(caspase?9)表达。结果 电镜检查可见凋亡细胞早期形态学变化；中、高剂量组腺垂体和肾上腺TUNEL阳性细胞的平均灰度值和procaspase?9 mRNA阳性细胞相对灰度值均为对照组的1?2倍以上(P<0?05)；蛋白印迹（western boltting)结果显示，随着染毒剂量的增加，垂体-肾上腺系统caspase?9表达逐渐增强(P<0?01)。结论 CdCl2可诱发腺垂体-肾上腺皮质细胞凋亡，在此过程中caspase?9及其酶原mRNA表达呈现出与凋亡较为一致的趋势。

【关键词】  镉

　　应激是机体面临或觉察到环境变化(应激原)对机体有威胁或挑战时作出的适应和应对过程，腺垂体?肾上腺皮质系统兴奋是应激过程中主要的内分泌改变〔1〕。镉作为一种常见的应激原，其作用于机体后腺垂体?肾上腺皮质系统的反应报道较少。我们从镉作用后腺垂体?肾上腺皮质系统的形态学变化及细胞凋亡发生的角度，观察镉亚慢性染毒后腺垂体?肾上腺皮质系统细胞凋亡情况及在此过程中，半胱天冬酶?9(cysteinvl aspartate specific proteinase?9，caspase?9)及其酶原(procaspase?9)mRNA的表达水平，为深入研究镉的内分泌毒性提供基础资料。

　　1  材料与方法

　　1?1  实验动物  清洁级雄性SD大鼠(中山大学动物中心；合格证号：粤检证字2001A039)，体重190～210g，实验前检疫1周。

　　1?2  试剂与仪器  氯化镉(CdCl2·5H2O，纯度>99％，广州化学试剂厂)；焦碳酸二乙酯(DEPC,美国Amresco公司)；procaspase?9mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德公司)；ZeissAxiovert研究型显微镜(德国ZEISS公司)；JVC ky2F30B 32CCD彩色图像摄录输入仪(日本JVC公司);Kontron IBAS215型全自动图像分析系统(德国Kontron公司）;SpectraA240型原子吸收分光光度计(美国Spectra公司)。

　　1?3  实验方法  将48只动物随机分为4组，每组12只，分别于每天上午8～9时经口灌胃给予1?0，2?0，4?0mg／kgCdCl2溶液，阴性对照组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，每周5d，连续6周。于染毒结束的次日晨8～9时断头处死大鼠，留取血清、腺垂体、肾上腺皮质进行测定：(1)应用石墨炉-原子吸收分光光度法测定血清镉水平；(2)取部分腺垂体和肾上腺皮质置于戊二醛—中性甲醛液中固定、制片、染色，HITACHI 600型透射电镜观察腺垂体和肾上腺皮质细胞超微结构变化；(3)采用原位末端标记法检测(TUNEL)细胞凋亡，并分析TUNEL阳性细胞的平均灰度；(4)采用原位杂交法并分析Procaspase?9mRNA表达水平；(5)用聚丙烯酰胺凝胶电泳?蛋白印迹?化学发光法检测caspase?9表达水平并用全自动图像分析系统进行吸光度分析。

　　1?4  统计分析  采用SPSS 10?0软件进行方差分析、回归分析、相关分析等。

　　2  结果

　　2?1  血镉水平变化(表1)  CdCl2染毒6周后，3个剂量组大鼠血镉水平明显升高，(P<0?05)，且随染毒剂量的增加，血镉水平呈不断升高趋势，回归方程为Y∧=0?718+0?111x(P<0?05,R2=0?885)。

　　2?2  腺垂体和肾上腺皮质细胞形态学改变  电镜可见，中、高剂量组腺垂体细胞及3个剂量组肾上腺皮质细胞均出现了线粒体肿胀成空泡状，嵴模糊甚至消失；细胞核体积缩小，核膜不规整，染色质边聚等细胞凋亡征象。

　　2?3  TUNEL法原位检测凋亡(表1)  结果表明，中、高剂量组腺垂体组织和肾上腺皮质组织中TUNEL阳性细胞平均灰度值与对照组比较呈现增高，凋亡细胞的平均灰度随CdCl2剂量增加趋于增强，呈明显的剂量依赖关系，以剂量为自变量，腺垂体组织TUNEL阳性细胞平均灰度值为因变量的回归方程为Y∧1=24?648+4?002x(P<0?05，R2=0?684)，肾上腺皮质组织TUNEL阳性细胞平均灰度值为因变量的回归方程为Y∧2=23?143+5?06x(P<0?01，R2=0?894)；相关分析结果表明，腺垂体组织和肾上腺皮质组织TUNEL阳性细胞平均灰度之间的Pearson相关系数r=0?895(P<0?01)。

　　2?4  Procaspase?9mRNA表达水平  2?0，4?0mg／kg CdCl2可影响腺垂体组织procaspase?9 mRNA的表达。回归分析结果显示，随着CdCl2剂量的增加，procaspase?9mRNA的表达逐渐增强，呈明显的剂量?效应关系。回归方程为Y∧3=0?499+0?053x（P<0?01，R2=0?560)；3个染毒剂量组CdCl2均可影响肾上腺皮质细胞procaspase?9 mRNA表达，以剂量为自变量，procaspase?9 mRNA表达水平为因变量的回归方程为Y∧4=0?640+0?078x(P<0?01，R2=0?804)；相关分析结果表明，腺垂体组织和肾上腺皮质组织procaspase?9 mRNA表达水平之间的Pearson相关系数r=0?895(P<0?01)。腺垂体procaspase?9 mRNA表达水平与TUNEL阳性细胞平均灰度之间的Pearson相关系数r=0?912（P<0?01），在肾上腺皮质组织，二者的Pearson相关系数r=0?793（P<0?01）。

　　2?5  caspase?9表达水平  采用聚丙烯酰胺凝胶电泳?蛋白印迹?化学发光法进行检测。结果显示，在腺垂体组织和肾上腺皮质组织caspase?9的表达随着CdCl2染毒剂量的增加均逐渐增强，表现为目的条带的积分吸光度(OPTDI)逐渐增大。

　　表1  大鼠血镉、腺垂体和肾上腺皮质凋亡及procaspase?9 mRNA、caspase?9表达结果（略）

　　注：与对照组比较，a P<0.05,b P<0.01

　　3  讨论

　　急慢性接触镉对机体多种组织器官均可产生损害作用〔2-4〕。本研究发现，镉在整体和离体均可对肾上腺皮质产生一定的损害作用〔5-7〕。腺垂体?肾上腺皮质系统在维持机体稳态方面发挥着极其重要作用的同时也是外源性化合物的靶点。本研究显示，低剂量镉亚慢性作用于机体可致腺垂体和肾上腺皮质均出现染色质边聚等凋亡表征。进一步研究显示，镉亚慢性染毒可使腺垂体和肾上腺皮质细胞DNA断裂，表现为TUNEL反应阳性，而且在腺垂体和肾上腺皮质组织TUNEL反应阳性细胞绝对灰度水平呈现出良好的一致性，从而在形态学和分子水平上均表明镉可致腺垂体?肾上腺皮质系统发生凋亡。蛋白酶信号转导系统在凋亡过程中的重要作用已引起广泛关注〔8-10〕，其中半胱天冬酶(caspase)家族被认为是诱发和执行凋亡最为关键的信号分子〔11，12〕，而半胱天冬酶?9(caspase?9)是半胱天冬酶级联反应的最上游成员〔13，14〕，其存在与否可作为判断凋亡是否发生的早期指标。本研究显示，caspase?9及其酶原mRNA(proca spas?9 mRNA)表达也呈现明显的剂量?效应关系，且在腺垂体和肾上腺皮质组织caspase?9及procaspase?9 mRNA表达和TUNEL阳性细胞之间均呈现出良好的相关性，提示caspase?9在镉诱导腺垂体?肾上腺皮质细胞凋亡过程中可能发挥了一定作用。

【】
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