丙型肝炎病毒包膜蛋白E1研究进展
【关键词】 丙型肝炎;丙肝病毒；包膜蛋白E1；疫苗
Advances research on HCV E1 envelope protein
【Abstract】 Hepatitis C,caused by hepatitis C virus(HCV),is an important infectious disease threatening human health,and at present,there are no vaccines available for preventing HCV infection.The E1 envelope protein is one of the structural protein of HCV,having important receptor binding site and epitope,it play important role in the process of viral infection and immunity.The study of molecular and functional character is significance for development of prophylactic and therapeutic vaccines against hepatitis C virus.Recent years,knowledge of the E1 protein,immune response in the organism,as well as the study of vaccine,has progressed substantially.Here the advances of studies on the E1 protein are reviewed.
【Key words】 hepatitis C;hepatitis C virus;E1 envelope protein;vaccine
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的慢性传染性疾病。目前全球HCV感染者约有1.7～2.0亿，我国约3800万人感染HCV。超过60%的HCV感染者可为慢性感染，而慢性HCV感染与肝硬化和肝癌直接相关。在美国、澳大利亚等西方国家，慢性HCV感染已是终末期肝病的首位病因。目前首选的治疗方法是联合聚乙二醇化的IFN-a与利巴韦林，但仅在40%～50%的感染者有较好的应答，彻底清除病毒者更为鲜见［1～3］。除了肝功能障碍的症状以外,HCV 感染常和多种自身免疫性疾病以及非柯杰金氏淋巴瘤等有关,对生活质量构成严重影响［4］。
由于HCV至少存在6种不同基因型，包膜糖蛋白(E1、 E2)有很高的突变率，HCV体外复制能力差，缺乏较敏感的组织培养方法，理想的动物模型亦难寻找，迄今为止，除黑猩猩之外，还未发现其他任何一种理想的HCV易感动物模型［5］。这对全面认识HCV的免疫清除机制以及评价疫苗的免疫效果均造成极大困难。这些因素使HCV疫苗研制面临巨大挑战。尽管如此，各国有关学者仍在不断探索，在HCV疫苗研制方面积累了较多研究资料，为最终成功地研制HCV疫苗奠定了基础。本文主要就HCV包膜糖蛋白E1方面的研究进展作一综述。
1 HCV基因组的结构及其作用机制
1.1 基因组结构 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)为单股正链RNA病毒，其基因组全长约9.5 kb，编码一个开放阅读框架，翻译成一个多聚蛋白前体，该前体蛋白被宿主信号肽酶和病毒自身蛋白酶加工为3种结构蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2)和7种非结构蛋白(p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b)。
1.2 包膜蛋白的结构及其作用机制 HCV结构蛋白(C,El和E2)在宿主内质网信号肽酶的作用下，裂解出El和E2蛋白。HCV El和E2蛋白高度糖基化，且羧基末端都有一个疏水区域，依此锚定于细胞质膜。HCV-E1蛋白含有192个氨基酸,含5～6个N-糖基化位点，是属于I型内源性糖基化蛋白［7］。E1糖基化后分子量约为30～35kD，脱糖基后为21kD。E1和E2糖蛋白构成HCV的包膜蛋白,是病毒的重要组成部分,该包膜蛋白部分或全部位于病毒颗粒表面并含有重要的中和性抗原表位,但其变异较大［6］。E1通过N末端与Core蛋白结合,也可以与NS2蛋白相互作用［8］，在病毒生命周期中起着重要的作用。E1和E2通过非共价键形成异源性二聚体,共同组成HCV病毒粒子的包膜, 其与病毒吸附和进入靶细胞过程有重要关系，因此,包膜蛋白普遍认为是疫苗研究的靶标［9］。
对HCV包膜蛋白天然构象的研究发现，El和E2之间可通过共价键相连，构成异源二聚体，如同是HCV病毒颗粒的功能亚单位。Deleersnyde等［10］人用构象敏感性MAbs作免疫沉淀试验对其特性作了进一步研究，并在显微镜下作了观察。免疫电镜下可观察到包膜糖蛋白定位在内质网膜上，说明HCV包膜的获得是在内质网膜萌出的过程中实现的，这一点与其他被膜病毒也完全一致。从内质网萌出后，HCV可通过细胞分泌途径或在细胞溶解过程中从感染细胞中释放出来［11］。可见HCV就像黄病毒的其他成员一样，其形态结构的形成源于细胞内结构而非来自外膜。实验中，当表达于哺乳动物细胞时，只有一部分EIE2正确折叠，正确折叠的EIE2糖蛋白即形成异源二聚体，其余部分则由于错误折叠形成二硫键连接的聚合体，不能通过分泌途径到达细胞膜表面。
2 E1蛋白在入胞过程中的作用
病毒表面糖蛋白介导病毒进入靶细胞的过程首先需要病毒与宿主细胞表面受体结合, 接着是病毒和细胞膜的融合, 如流感病毒、黄病毒、蜱体脑炎病毒等。然而,HCV 进入靶细胞的过程还不清楚。1996年,Rosa等［12］发现哺乳动物细胞表达的重组E2或E1/E2蛋白免疫黑猩猩，对同源HCV攻击有保护作用,表明E1在病毒吸附靶细胞过程中具有重要作用，同时提示靶细胞表面存在能与E1结合的结构。
Lagging等［13］发现HCV-DNA疫苗免疫接种BALB/c小鼠后,可诱导BALB/c小鼠产生强烈的体液免疫应答,将HCV的E1(192aa～383aa)和E2(384aa～809aa)区与疱疹病毒G蛋白的跨膜区和胞质尾区构建成嵌合基因,在转化细胞中可组装成假型病毒(VSV/HCV)，该假病毒可以感染真核细胞;然后用同源性HCV分离株的包膜糖蛋白免疫黑猩猩获得的免疫血清在体外进行中和实验,发现抗血清可以阻断假型病毒对细胞的感染,提示E1在假型病毒感染真核细胞中起着重要作用。研究表明［14］，在HCV E1基因的原核表达中，由于E1蛋白C末端的跨膜区（TM）与大肠杆菌的细胞膜相互作用而改变其通透性，导致细菌细胞的溶解、死亡，因此，E1 TM区的“膜激活”特性是HCV E1基因难于在原核系统中完全表达的原因。由此推测，HCV-E1蛋白可能对于病毒的脱壳、进入细胞、与内质网膜结合等病毒-细胞的相互作用中起重要作用，HCV E1的研究对阐明HCV的致病机理将会有重要意义。
3 E1与机体的免疫反应（E1的免疫学表位）
HCV 感染宿主后,宿主首先接触的是包膜蛋白,该蛋白对于宿主产生体液免疫反应很重要，同时宿主的保护性免疫常依赖于针对病毒表面蛋白的抗体，该抗体能阻断病毒与敏感细胞的结合，并通过加强细胞免疫清除病毒，因此研究针对HCV包膜糖蛋白的体液免疫具有重要意义。由于HCV没有其他动物模型，有关HCV感染天然体液免疫反应的研究，只能在HCV感染者中进行。根据外膜区的氨基酸序列，合成一系列相互重叠的多肽作为抗原，通过和病人进行反应，可以筛选到外膜区的抗原表位。Ray等用这种方法研究表明［15］，在E1区存在两段潜在的抗原表位，P1：210～223，P2：315～327，P1位于变异较大的区域，P2位于高度保守的区域，在38份感染者血清标本中，有35份（92%）与P2反应，仅17份（44 .7%）与P1反应。而Keck ZY等［16］ 在对抗HCV单克隆抗体的筛选中，发现单抗H111可识别E1/N端序列“YEVRNVSGVYH”，并发现该单抗可以阻断病毒对敏感细胞的吸附和感染，进一步研究发现这种中和活性对基因型1a,1b,2b和3a均有交叉中和性，推测这个区域可能是一个高度保守的中和性抗原表位。
4 E1糖蛋白和HCV疫苗的研究
目前认为，理想的HCV疫苗应具有双重功能:(1)可产生交叉活性的体液免疫反应以中和大多感染的病毒株;(2)并可建立强大的CTL免疫，清除那些逃过抗体中和反应的病毒株的进一步传播［17］。
在早期的研究中，以真核表达E1/E2免疫原为主，Ralston等［18］用重组痘苗病毒载体转染哺乳动物细胞地表达了HCV全长结构蛋白，发现虽可获得高效表达，所表达的E1和E2包膜糖蛋白易形成复合物。用纯化的包膜糖蛋白的E1E2复合物免疫黑猩猩可产生高滴度的抗E1和E2抗体。而应用E1包膜糖蛋白仅能刺激机体产生弱的免疫反应，提示E1//E2包膜糖蛋白形成的异源二聚体可能对激发强免疫应答是必要的。
1994年，Choo等［19］ 报道了用真核表达的重组HCV包膜蛋白E1(gp33)和E2 (gp72)免疫接种黑猩猩的研究。他们用重组痘苗病毒为载体，在Hela细胞中表达HCV包膜糖蛋白E1和E2,加佐剂制成HCV疫苗，在0、1、7月份对7只黑猩猩进行免疫，均产生了抗E1、抗E2抗体，而且效价高于慢性HCV感染者，在最后一次加强免疫后2～3周，用约10个CID50的HCV由静脉攻击动物，5只对照组黑猩猩均发生了HCV感染，而7只免疫动物中有5只获得了完全性保护，另2只抗HCV-E抗体效价<15000的黑猩猩，虽呈一过性HCV感染，表现为血清HCV RNA短暂阳性和丙氨酸转氨酶值一过性升高，但没有转化为慢性感染。说明真核表达的可溶性重组抗原不单具有良好的免疫原性，而且确可激发中和性的免疫反应。
随后，人们开始进行原核表达E1蛋白免疫原性的研究，徐进平等［20］在原核系统中高效表达的全长HCV E1蛋白,经纯化后免疫小鼠和家兔后,E1蛋白也可诱生较高水平的特异性体液免疫应答。小鼠和兔抗E1 IgG抗体水平在第8周达到高峰,且兔的应答水平较小鼠维持更好，说明原核表达的HCV E1融合蛋白具有良好的免疫原性,能诱导免疫实验动物产生特异性的体液免疫应答。同时,小鼠CD8+T细胞数量在免疫后有明显升高，提示E1包涵体蛋白能诱发较高水平的细胞免疫应答。原核表达的HCV E1蛋白为非糖基化蛋白,并形成包涵体，用E1包涵体蛋白免疫小鼠和兔能诱发较高水平的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，推测E1糖基化并不是其具有免疫原性所必须的。一般而言，用可溶性蛋白质免疫原,诱导机体体液免疫的效果是很好的,但对提高机体细胞免疫效果往往不显著。HCV E1包涵体抗原呈现良好的体液免疫和细胞免疫效果，推测这种包涵体结构作为抗原不同于可溶性蛋白,包涵体进入机体后可被细胞吞噬，然后在细胞内缓慢溶解, 产生类似DNA疫苗的效果，有利于E1抗原通过内源性抗原呈递途径,激活CTL反应。我国上海生化所分别克隆了192～340aa和192～383aa两个片段，在E.Coli中，前者获得了表达，后者不表达。表达产物经纯化，用WB检测，可以和用哺乳动物细胞表达的E1免疫后产生的抗体发生交叉反应。由此推断，原核表达的抗原和真核表达的抗原享有同样的抗原性［21］。
近年来，核酸免疫技术的出现，为HCV疫苗的研制提供了新的手段。DNA免疫是直接将含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA注入体内，经细胞摄取、转录、翻译、表达出相应抗原，然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答。在HCV的防治中，核酸疫苗与传统的重组疫苗及多肽疫苗相比，具有以下优势:(1)具有交叉保护作用，有利于克服HCV外膜基因的高变性;(2)核酸免疫的抗原肽的递呈过程与感染相似，直接将具有天然构象的蛋白呈递给免疫系统，不会造成构象的改变或丢失;(3)核酸免疫同时诱发机体的体液免疫与细胞免疫。
Ezelle等［22］运用能表达HCV结构区蛋白(C,E1,E2)的重组的水泡口炎病毒(VSV)载体免疫动物，结果发现免疫小鼠产生较强的针对所有HCV结构区蛋白的细胞免疫和体液免疫，尤其是针对HCV-E2的体液免疫，因而得出，表达HCV结构区蛋白的VSV重组病毒疫苗是可作为研制抗HCV感染和性疫苗的一种方法，但还未见到进行黑猩猩和临床研究的报道。
2003年，Duenas-Carrera等［23］运用编码HCV-C,E蛋白的DNA疫苗免疫兔子和恒河猴，结果发现，初次免疫28周后，所有兔子产生了较强的抗C、E反应，抗体滴度分别达到1:1500,1:400;免疫52周后，恒河猴出现滴度为1:3500的抗HCV结构区抗原的抗体，因而得出，包含HCV结构区的DNA疫苗在动物体中能诱导出体液及细胞免疫反应。
以上都只是临床前的HCV疫苗的研究，近年来人们在临床方面取得了一定成果，Geert Leroux-Roels等［24］在I期临床中，选取了1b型的E1（aa192－326）的共同序列在重组痘苗病毒中表达纯化后对20位志愿者肌肉注射后，研究表明，三次免疫后可以引起明显的E1抗体反应，通过第4次加强免疫后反应增强，同时，在所有的志愿者中都可以诱发针对E1的强烈的细胞免疫反应，研究表明，此E1治疗性候选疫苗具有良好的安全性和免疫原性方面。Baryluk A等［25］用含有HCV/E1的质粒和重组腺病毒进行的治疗性疫苗的研究，已进行了临床研究，在I期临床研究证明安全性的基础上并已进入II期临床研究。在Ⅰ期临床研究中也发现疫苗可成功地激发了体液和细胞的免疫反应。在Ⅱ期临床研究中,重组的E1疫苗可激发强烈的针对E1的T细胞反应，部分病人血清ALT水平的明显下降。此外,在用E1治疗性疫苗的患者中,其肝脏组织学纤维化评分有改善，但HVC RNA 载量无改变。这些仍需长期研究，拟进行II-b期临床试验。目前进行的临床研究进一步说明了包膜蛋白E1作为HCV治疗性疫苗免疫原的可取性，但由于仅局限于安全性与免疫原性的研究，且抗原的选择单一，一般只能产生针对一种基因型的免疫反应，在病毒的中和方面效果不太明显，治疗作用不显著。鉴于上述原因，针对E1的研究仍需进一步深入。
5 结语
虽然目前针对E1的治疗性疫苗的研究已进入II期临床研究临床实验阶段，但只在安全性方面取得了一定的成果，还没有达到治疗性的目的，因此针对E1的研究仍需进一步深入。E1不仅存在中和性抗原表位,还可能有细胞毒性T淋巴细胞识别位点，因此,进一步深入研究HCV E1 的变异及其特点,设计研究和制备具有治疗性的安全高效的HCV疫苗仍然是摆在我们面前的一项紧迫而重要的任务。
随着分子生物学技术的及细胞病毒学的研究。未来的丙型肝炎疫苗应包括各种不同重组的HCV毒株，或根据各地流行的HCV毒株来构建丙型肝炎疫苗。同时，优选具有良好的免疫原性、高度保守的B/T细胞表位，组合成一个多表位多基因型的复合疫苗，应可有效地激发机体的体液和细胞两种免疫反应，有望达到治疗HCV慢性感染的目的，研制出更为高效的治疗性及预防性HCV疫苗。
【】
1 Drusano GL , Preston SL. A 482week duration of therapy with pegylated interferon alpha 2b plus ribavirin may be too short to maximize long-term response among patients infected with genotype-1 hepatitis C virus. J Infect Dis, 2004 , 189(6):964-970.
2 凌世淦.丙型肝炎疫苗研究的挑战与希望［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（11）：921-926.
3 Nakamura H, Uyama H, Enomoto H, et al. The combination therapy of interferon and amantadine hydrochloride for patients with chronic hepatitis C. Heptogastroenterology, 2003 , 50(49) : 222-226.
4 Ramos M, Trejo O , Garcia M,et al.Triple association between hepatitis C virus infection,systemic autoimmune diseases and B cell lymphoma. J Rheumatol,2004,31(3):495-499.
5 廖小玲，戚中田.丙型肝炎疫苗的研究进展.免疫学杂志, 2005，21（3）：25-27.
6 Forns X, Thimme R, Govindarajan S. Hepatitis C virus lacking the hypervariable region 1 of the second envelope protein is infection and causes acute resolving or persistent infection in chimpanzees.Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97:13318-13323.
7 Santolini E , Migliaccio G, La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of hepatits C virus core protein.J Virol,1994,68:3631-3641.
8 Dubuhission J,Rice C M. Hepatitis C Virus glycoprotein folding : disuphide bond formation and association with calnexin.J Virol, 1996,70:778-786.
9 Li L,Ye LB,Gao JR,et al.Expression and purification of HCV truncated core gene and its ELISA Essay.J Wuhan Univ ( Nat Sci Ed), 1999, 45 (Special Issue):17-20(Ch).
10 Deleersnyder V，Pillez A, Wychowski C，et al. J Virol,1997,71:697-704.
11 Flint M，Thomas JM，Maidens CM，et al. J Virol，1999,73(8):6782- 6790.
12 Rosa D, Campagnoli S, Moretto C，et al. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(5):1759-1763.
13 Lagging LM, Meyer K, Owens RJ, et al. Functional role of hepatitis C virus chimeric glycoproteins in the infectivity pseudotyped virus. J Virol, 1998,72 :3539-3546.
14 Ciccaglione AR, Marcantonio C, Costantino A,et al. Hepatitis C virus E1 protein induces modification of membrane permeability in E.coli cells. Virology,1998,250:1.
15 Ray R,Khanna A,Lagging L M ,et al .Peptide immunogen mimicry of putative E1 glycoprotein specific epitopes in hepatitis C Virus.J Virol,1994,68:4420-4426.
16 Zhen YK,Vicky M,H.Sung,et al.Human monoclonal antibody to hepatitis C virus E1 glyc blocks virus attachment and viral infectivity.J Virol,2004,78(13):7257-7263.
17 Zucchelli S, Roccasecca R, Meola A, et al. Hepatology,2001,33:692-703.
18 Ralston R,ThudiumK，Berger K,et al.Cheracteristics of hepatitis C virus envelope glycoprotein comple,as expressd by recombinant vaccinia viruses.J Viral,1993,67,6753-6755.
19 Choo Q L, Kuo G, Ralston. Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus. Proc Nat I Acad Sci USA, 1994, 91:1294-1298.
20 徐进平. 丙型肝炎病毒包膜蛋白E1 在小鼠和家兔中免疫应答研究. 武汉大学学报(版) , 2002,48(6):725-728.
21 Liu J. Purification and application of C-terminally truncated hepatitis C virus E1 proteins expressed in Escherichia coli. WJG, 2005,Jan 28;11(4):503-507.
22 Ezelle HJ,Markovic D,Barber GN.Generation of hepatitis C virus-like particles by use of a recombinant vesicular stomatitis virus vector.J Virol,2002,76(23):12325-12334.
23 Duenas-Carrera S, Vina A, Martinez R, et al. Immunization with a DNA vaccine encoding the hepatitis C virus structural antigens elicits specific immune response against the capsid and envelope proteins in rabbits and macaque vsfirus.Biotechnol Appl Biochem. 2004 Apr;39(Pt 2):249-255.
24 Geert Leroux-Roels, Erik Depla. A candidate vaccine based on the hepatitis C E1 protein: tolerability and immunogenicity in healthy volunteers.Vaccine 2004,22(23-24):3080-3086.
25 Baryluk A,Polz-Dacewicz M,Sendecka M. Modern achievements in research on hepatitis C vaccine. Postepy Hig Med Dosw (Online). 2005，59: 98-104.
