人乳头瘤病毒（HPV）疫苗的研究进展

　李娟　王佑春　宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的疾病，每年约有50万新发病例，25万人死亡，是引起妇女死亡的第二大原因，其中大部分在家，占80%左右［1］。1977年德国学者ZurHausen等从宫颈癌标本中发现了人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）DNA，推测HPV感染与宫颈癌发生有关。进一步的分子流行病学证据表明，HPV与人类多种癌症，特别是与宫颈癌有着密切的关系。由国际癌症研究机构（IARC）组织在22个国家进行了针对引起侵袭性宫颈癌（ICC）的HPV类型的调查［2］。组织学确诊为ICC的1000个病例中有99.7%发现HPVDNA阳性，其上HPV的类型主要为HPV16（53%）和HPV18（15%）。　　1机体对HPV感染的免疫反应HPV属乳头多瘤空泡病毒科（Papovaviridae）乳头瘤病毒属，是一类感染表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒。其基因组为双链环状DNA，长7.5～8.0kb，含8个开放阅读框（openreadingframes，ORFs），依功能不同分3个区:（1）早期区（earlyregion，E区）:分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能。（2）晚期区（lateregion，L区）:编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2。（3）非编码区（uncodingregion，UCR）或上游调控区（URR）:含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。按照HPV感染与宫颈癌发生的危险性，将HPV分为低危型（HPV1，6，11等）和高危型（HPV16，18，31，45等）。低危型HPV主要引起表皮细胞良性增生，如HPV6和11型可引起生殖器疣和儿童复发性乳头瘤。高危型HPV与宫颈上皮内瘤的发生和恶变以及其他上皮性肿瘤的发生相关。HPV感染在人群中较为普通，大部分人在性生活开始后，都感染过该病毒。病毒通过受损的上皮组织进入基底层细胞，其复制周期受严格的调节，并依赖于病毒编码的蛋白质和宿主上皮细胞的分化程度。病毒感染通常为局部限制性，不引起炎症反应。大多数人都能自行清除病毒，只有一小部分人由于免疫系统的原因无法清除病毒，造成HPV持续存在，继而发展为宫颈癌。许多证据表明HPV感染能激发宿主免疫反应，如大多数皮肤疣两年内可自发消退，且多处感染灶同时消退［3］。大多数人在性生活开始后，都感染过HPV，随后感染率降低，说明免疫系统可以清除病毒并长期产生保护作用。HPV中和抗体可以保护机体免受病毒的感染，但对已经存在的病毒，则需要细胞免疫来清除已感染的细胞。在宫颈损伤病人的消退过程中大多可检测到细胞免疫反应的升高［4］;而免疫抑制如器官移植时，病人患疣的机率增大;HIV病人比健康人患尖锐湿疣的机率高2～7倍;由此可见，细胞介导的免疫机制对于控制HPV感染有重要的作用。2HPV疫苗研究现状　　由于从感染灶组织中很难分离到病毒体，迄今未能建立体外培养系统进行病毒培养。目前对宫颈癌的基本以手术和放疗为主，给病人带来很大的痛苦。预防HPV相关癌症的最有效的方法是研制特异性的疫苗，诱导机体产生中和抗体，激发保护性免疫反应，达到有效预防与癌症相关型的HPV传播的目的，降低宫颈癌的发生率，并且可能降低与HPV感染弱相关的癌症如肛门、外阴或扁桃体癌的发生率。由于E6、E7蛋白具有转化活性，使用全病毒做疫苗有致癌的危险，因此，目前的研制方向主要集中在亚单位疫苗方面。根据其功能不同，疫苗分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗多以HPV的主要衣壳蛋白L1体外表达形成的病毒样颗粒（VLPs）为靶抗原，诱导机体产生特异性的中和抗体。治疗性疫苗则以HPV早期蛋白如改造过的E6、E7蛋白作为靶抗原，诱导产生特异性的细胞免疫反应，用于CIN和宫颈癌的免疫治疗。近年来研究的如嵌合型病毒样颗粒疫苗、HPV假病毒疫苗等同时具有预防和治疗双重功能。2.1病毒样颗粒（VLPs）HPV有两种衣壳蛋白，主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。在天然HPV病毒颗粒形成过程中，衣壳蛋白包装病毒DNA形成成熟的病毒颗粒。研究表明，在许多表达体系如哺乳动物细胞、酵母和细菌［5，6］中，单独L1或L1和L2共表达后可自行组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒（VLPs），这种VLPs结构与天然的病毒颗粒相似，用来免疫动物诱导产生高滴度的中和抗体，证明在VLP表面存在中和抗体的表位［7］。由于L1抗体识别构象依赖的型特异表位，因此，保持一定的空间构象对VLP的免疫原性非常重要。当其变性后便失去诱导产生中和抗体的能力。HPVVLPs还能通过MHCI途径诱导产生细胞免疫。HPV16型L1装配成的VLPs经鼻免疫小鼠后，可在脾及阴道淋巴组织中发生淋巴细胞增殖。以产生IFN-γ的CD4+T细胞增为主，髂骨淋巴细胞中增生的T淋巴细胞具有CTL活性，说明VLPs可诱导MHCI类限制性CD8+反应［8］。动物实验证明VLP诱导产生的抗体对动物的保护率几乎达到100%，说明体液免疫足够保护机体免受病毒的感染。对VLP疫苗进行的一些临床试验也证明了其安全有效性。在健康人群中进行的随机、双盲实验对HPV16L1VLP的安全性和免疫原性进行了评价。结果表明所有的疫苗均有极好的耐受性，受试者均发生血清阳转，在没有佐剂的情况下也有很好的免疫原性［9］。HPV11L1VLP在健康志愿者中进行的Ⅰ期临床试验得到相似的结果。由Merck，GlaxoSmithKline和NIH生产的VLPs疫苗和不同的早期蛋白与L1/L2蛋白组成嵌和病毒样颗粒cVLP正在进行Ⅲ期临床试验［10］。Ⅰ和Ⅱ期临床实验证明HPVVLPs疫苗是安全的，并有高度的免疫原性，VLPs免疫后诱导产生的中和抗体效价是感染的100倍。1998年10月～1999年11月，在美国女性中进行了HPV16L1VLP临床试验。酵母表达的VLP纯化后吸附于铝佐剂，免疫组抗体效价远远高于对照组。免疫后17.4个月跟踪调查显示，对照组HPV16持续感染率为3.8%，免疫组为0。所有9例HPV16相关的宫颈上皮内瘤均发生在对照组［11］。该实验结果充分说明了VLP是最有前途的疫苗之一。高危型HPV的早期蛋白E6、E7持续表达于HPV感染的肿瘤细胞上，因此，可作为诱导肿瘤特异性CTL反应的最佳靶抗原。Muller等［12］用HPV16E7蛋白部分序列代替L1蛋白C端34的氨基酸，构建了cVLP。实验证明C端插入60个氨基酸不影响VLP的形成，免疫动物后诱导产生中和抗体。因此，利用这一特点，C端还可以插入其它HPV特异序列或非HPV特异序列，如已知的肿瘤抗原的T细胞表位。各种研究证明不同HPV诱导的中和抗体的保护作用具有型特异性。使用ELISA和交叉中和实验对九种HPV（6，11，16，18，31，33，35，39，45）亚型进行了免疫活性分析，HPV衣壳蛋白具有高度的免疫原性和型特异性，但不同类型之间的交叉中和活性很低［13］。体外感染实验表明只有同型的VLP抗血清才能中和假病毒颗粒。因此，许多疫苗采用多型混合免疫的策略，如包括16，18，31和45的VLPs能够预防75%的宫颈癌［1］。在预防性疫苗VLPs中至少还应该包括一种非癌基因型HPV，如HPV6主要引起生殖疣，针对它的抗体与HPV11有交叉中和活性，而HPV11是引起生殖疣的第二大原因。包括低危型HPV的多价疫苗有可能解决生殖疣高频率发生的问题和治疗上的困难。2.2DNA疫苗DNA疫苗是将编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入体内，外源基因表达后呈递给免疫系统，分别诱导产生细胞免疫和体液免疫应答。在过去的十多年里，DNA疫苗研究已经从实验室发展到初步的临床试验阶段，成为防治传染病、肿瘤的研究热点。目前研究的HPVDNA疫苗既有包含早期基因的治疗性疫苗，也有包含晚期基因的预防性疫苗。HPV16L1DNA疫苗能有效刺激阴道CD8+T细胞，这对消除病毒感染的细胞十分重要。当生殖道粘膜基底层鳞状上皮细胞暴露于病毒时，就会感染HPV。有效预防HPV感染的疫苗应该在病毒入侵的局部提供免疫保护作用。分泌型IgA能够与病毒结合，阻止其附着上皮细胞，因此，具有病毒中和活性的SIgA在预防局部感染和疾病的发生中起着重要的作用，是预防病毒侵入的第一道防线。在人和猴子的生殖道粘膜组织中检测细胞免疫和抗体分泌细胞证实，恰当的免疫途径能够在生殖道诱发产生抗体和CTL反应。HPV16L1DNA疫苗鼻腔免疫BALB/c后，产后细胞免疫和阴道粘膜局部免疫，但只能诱发弱的体液免疫反应。因此，鼻内免疫不能作为一个有效的途径，可以与HPV16L1VLP结合使用，增强VLP的免疫能力［14］。其他的一些实验证实粘膜免疫不仅发生在疫苗注射部位，还可发生在远端粘膜部位［15］。HPV16E7DNA疫苗免疫小鼠，诱导产生较强的E7特异性CTL反应，保护小鼠免受肿瘤细胞的攻击。使用突变的E7DNA疫苗免疫产生的保护作用优于野生型DNA疫苗免疫效果。由于E7蛋白的转化活性，采用不同方法将其突变来消除转化活性，增加疫苗的安全性［16］。使用改造过的DNA免疫C57BL/6小鼠，不仅诱导产生E7特异性CTL，还能保护小鼠免受E7阳性肿瘤细胞的攻击。DNA疫苗的安全性，特别是免疫后质粒的组织分布和整合是限制其应用的主要问题。不同实验室对此类问题进行了多方面的研究［17，18］，没有发现外源DNA与基因组整合的证据，同时还证明DNA疫苗接种后不会诱导产生自身DNA抗体，引起免疫系统功能紊乱。