RHBV疫苗接种引起的特异性细胞免疫反应
【关键词】 HBV疫苗；免疫接种；小鼠；脾T淋巴细胞；IL-2；IFNr；CTL反应
The cellular immune response to recombinant HBV vaccine
【Abstract】 Objective Hepatitis B virus(HBV) surface vaccine(rHBs) specific MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses induced by immunization with rHBs in murine were assayed.Methods BALB/c(H-2d) murine were injected intraperitoneal(i.p.)with rHBs at doses ranging from 0-6 μg and boosted after 2 weeks. 4 weeks after the last immunization，to measure the IL-2 and IFNr，spleen lymphocytes were harvested and restimulated with rHBs in experimental group or with PBS as control，4 weeks later after the last vaccination. For CTL assay，spleen cells were restimulated in vitro with specific peptides，which represents a Ld-restricted CTL epitope of the S-protein in H-2d BALB/c murine. The specific cytotoxic reactivity of in vivo primed and in vitro restimulated cells was tested against P815 cells impulsed with specific peptides and labeled with 51Cr. 4 hours release assay of 51Cr was performed. Results 2 weeks after primary vaccination，the IL-2 were 5.48±8.88，9.28±6.98，28.53±14.32，64.69±20.88 respectively；IFNr were 8.22±8.61，9.89±9.34，20.27±15.50，30.77±22.12 separately. 2 weeks after boost vaccination，the IL-2 were 5.75±5.04，102.53±67.52，177.13±91.12，332.10±124.31 separately；IFNr were 3.63±4.42，28.33±13.04，59.66±25.75，80.73±19.30 separately. For CTL assay，the percentages of specific release of the mouse spleen lymphocyte in group 0.65 μg、1.25 μg、2.5 μg、5 μg were 42.36%±19.32%、91.21%±22.97%、69.25%±24.13%、51.49%±21.661%，respectively. For the mouse receive only priming vaccination，the percentages of specific release of the mouse spleen lymphocyte in group 0.65、1.25、2.5、5 were 32.27%±15.35%、56.28%±24.35%、44.34%±18.65%、40.76±56% respectively. Conclusion Injection with rHBs efficiently prime MHC-I restricted CTL response to the S-HBsAg in BALB/c(H-2d) murine，which was enhanced by boosting injection.
【Key words】 rHBs；murine；immunization；spleen T lymphocytes；IL-2；IFNr；CTL reaction
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一种严重危害人体健康的常见疾病，全世界有3.5亿HBV感染者。接种基因重组HBV表面抗原疫苗(recombinant HBV surface vaccine，rHBs)能产生保护性抗体，已广泛用于预防HBV感染。然而抗HBV特异性细胞免疫反应决定HBV感染的预后，细胞免疫反应不足，即使抗HBV特异性体液免疫反应较强，也常导致HBV持续感染，清除体内已有的HBV、HBV感染需要较强的抗HBV特异性细胞免疫反应。
接种rHBs能否产生HBV特异性细胞免疫反应，能否用于治疗HBV感染还不十分清楚。笔者给小鼠接种rHBs，研究其脾T淋巴细胞能否产生特异性CTL反应，能否释放特异性细胞因子，对接种rHBs产生的特异性细胞免疫反应进行定量及功能分析。
1 资料与方法
1.1 试剂 rHBs含HBV表面抗原preS2/S，酵母基因重组产品，Merck公司生产。合成的特异性多肽IPQSLDSWWTSL(S28-39)，为H-2d BALB/c小鼠Ld限制rHBs-CTL表位(Saibaisheng公司生产)，以50 mg/ml浓度溶解在70%乙腈或0.1% DMSO储存液中，临用前以培养液稀释。Na251CrO4购自同位素公司。IL-2及r-IFN检测试剂盒：U-CyTech公司。
1.2 实验动物 BALB/c小鼠。6～10周龄，SPF级。
1.3 方法
1.3.1 BALB/c小鼠免疫接种 小鼠按以下分组，腹腔内分别接种不同剂量的rHBs，一半小鼠2周后加强免疫接种1次，另一半只接种1次：0.65组(10只)，接种0.65μg的rHBs；1.25组(10只)，接种1.25μg的rHBs；2.5组(10只)，接种2.5μg的rHBs；5组(10只)，接种5μg的rHBs。
1.3.2 小鼠脾T淋巴细胞分离培养 接种后2周，氯仿麻醉小鼠，脱颈处死小鼠，分离脾细胞，8.3% NH4Cl/0.17mol/LTris (pH 7.4)37℃作用10min去除红细胞，过玻璃毛柱，收集T淋巴细胞；用100：1含10% 胎牛血清、5×10-5mol/L二硫苏糖醇的DMEM完全培养液，以5×105/well浓度接种在96孔细胞培养板上，每例作3个重复孔。
1.3.3 IL-2、IFNr释放实验 小鼠脾T淋巴细胞，用10μg/ml rHBs体外刺激3天后，用U-CyTech公司的ELISA检测试剂盒测定培养上清的IL-2及FNr浓度。
1.3.4 51Cr释放CTL反应 靶细胞，P815细胞用特异性多肽处理，用100ul Na251CrO4在二氧化碳培养箱37℃标记１h。效应细胞，用含10% FCS的DMEM培养液悬浮小鼠脾细胞，加巯基乙醇至5×10-5M、小鼠IL-2至5u/ml，二氧化碳培养箱内培养5天后，培养液冲洗２次，按100:1、50:1与104标记的靶细胞在96孔细胞培养板上反应４h，每个实验对象检测3次；离心后，取100ul上清用r-记数计检测放射性，用以下公式特异性释放率，CTL特异性释放率=(实验组释放的量-自然释放的量)/(最大释放的量-自然释放的量)。
1.4 统计学处理 CTL特异性释放率、培养上清的IL-2及r-IFN浓度以平均数±标准差来表示(x±s)，不同组小鼠脾T淋巴细胞释放的IL-2及IFNr比较、CTL特异性释放率比较均用t检验。
2 结果
2.1 小鼠脾T淋巴细胞特异性CTL反应 只接受1次免疫接种的小鼠脾淋巴细胞特异性CTL反应，0.65、1.25、2.5、5组小鼠CTL特异性释放率分别为(32.27±15.35)%、(56.28±24.35)%、(44.34±18.65)%、(40.76±56)%。
接受2次免疫接种的小鼠脾淋巴细胞与未经特异性多肽作用的靶细胞反应，CTL特异性释放率分别为：(42.36±19.32)%、(91.21±22.97)%、(69.25±24.13)%、(51.49±21.661)%。
2.2 小鼠脾T淋巴细胞释放的IL-2和IFN-r 结果见表1。表1 各组小鼠初次免疫及加强免疫脾T淋巴细胞释放的IL-2和FN-r
Tab 1 The production of IL-2 and IFN-r from the spleen T lymphocyte from the mouse boost vaccinated with rHBs （ng/L，x±s，n=40）
Notes: vs control 0.05；**Ｐgroup*P<<0.01
3 讨论
HBV感染是一种严重危害人体健康的常见疾病，全世界有3.5亿HBV感染者。多数成年人感染HBV后，机体能够自动清除HBV，表现出一种急性、自限性病程，而只有5%的成年人感染HBV后，虽然有强烈的抗HBV特异性体液免疫反应，但由于抗HBV特异性细胞免疫反应较差、机体免疫反应不能清除HBV而成为慢性HBV感染，其中部分患者最终成为肝硬化、肝癌。目前HBV感染主要是干扰素(interfern，IFN)及拉米夫定(lamivudine)，但只对转氨酶增高的部分患者有效，而且存在副作用较多、停药后易复发等缺陷。疫苗接种能激发机体产生特异性免疫反应，是预防及治疗病原微生物感染简单有效的方法；rHBs接种能产生强烈的抗HBV特异性体液免疫反应，很早就用于预防HBV感染，但是接种rHBs能否产生较强的抗HBV特异性细胞免疫反应，能否治疗HBV感染还不十分清楚。笔者给小鼠接种rHBs，研究其脾T淋巴细胞能否产生特异性淋巴细胞CTL反应，能否释放特异性细胞因子，对接种rHBs产生的特异性细胞免疫反应进行定量及功能分析［1～6］。
研究发现，接种rHBs的小鼠脾T淋巴细胞在体外再受rHBs或HBV特异性多肽刺激后：(1) 特异性CTL反应 各实验组特异性CTL释放率以1.25组的最大，0.65组的最小。提示随着rHBs接种剂量增加，开始时特异性CTL反应逐步增强，1.25μg rHBs接种剂量的CTL特异性释放率达到最高值，进一步增加接种剂量并不能增强特异性CTL反应，CTL特异性释放率反而降低。同一剂量组的小鼠，加强免疫组的CTL特异性释放率普遍比单次免疫组的高，二者差异有显著性，表明加强免疫也能增强特异性CTL反应。(2) IL-2、IFN-r的分泌是剂量依赖性的，加强免疫或增加接种剂量使脾T淋巴细胞特异性CTL反应、IL-2，IFN-r的分泌显著增加；(3) CTL反应、IL-2、IFN-r的分泌是HBV特异性的：不论是哪一个剂量组，不论是加强免疫还是单次免疫，淋巴细胞CTL反应中，小鼠脾T淋巴细胞均在体外用HBV特异性多肽刺激，检测的是HBV特异性CTL释放率；而小鼠脾T淋巴细胞分泌IL-2、IFNr的实验，小鼠脾T淋巴细胞均在体外用rHBs刺激，检测的是HBV特异性IL-2、IFNr释放。(4)小鼠脾T淋巴细胞特异性CTL反应强度与其分泌的IL-2、IFNr有密切的相关性，CTL反应较强的组的IL-2、IFNr分泌也较高，反之亦然。IL-2、IFN-r主要由CD4(+)的I型辅助T淋巴细胞(helper spleen lymphocyte type I subtype)分泌；CTL实验反映的是CD8(+)T淋巴细胞的功能，CD4(+)与CD8(+)T淋巴细胞在抗原呈递、免疫信号传递等免疫反应环节中，相互依赖、相互作用，CD4(+)T淋巴细胞通过分泌的淋巴细胞因子调节CTL功能，而CTL也分泌淋巴细胞因子；这可以解释小鼠脾T淋巴细胞特异性CTL反应与IL-2、IFN-r分泌二者之间密切关系。
机体免疫反应能够清除HBV的急性、自限性HBV感染者，其体内存在抗HBV的多克隆、多特异性细胞免疫反应，包括CD4(+)的I型辅助T淋巴细胞(T helper lymphocyte，Th1)分泌的细胞因子(IFNr，TNFa，IL-2)产生的非细胞溶解性抗HBV作用及CD8(+)的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对HBV感染肝细胞的细胞溶解性抗HBV作用。研究发现，在淋巴细胞浸润肝脏组织达高峰之前，机体已开始清除体内的HBV，而且与IFNr分泌高峰的时相一致，提示I型淋巴细胞分泌的细胞因子产生的非细胞溶解性抗HBV作用在CTL对HBV感染肝细胞的细胞溶解性抗HBV作用之前即发挥作用，在机体清除HBV过程中起着重要作用。但在抑制、清除肝细胞胞浆及肝细胞胞核的HBV共价、闭合、环状DNA(covalently colsed circular DNA，cccDNA)的复制、清除体内HBV、治疗HBV感染的过程中，CTL的细胞溶解性抗HBV作用则起着不可替代的作用。
对于机体免疫反应不能清除体内HBV的HBV慢性感染者，抗HBV特异性细胞免疫反应较弱，提示增强抗HBV特异性细胞免疫反应有助于清除体内的HBV，接种rHBs可以用于治疗HBV感染。现在临床上使用的抗HBV特异性免疫球蛋白对预防HBV感染有效，但对治疗体内已感染的HBV无效［7～9］。
由于HBV感染引起的免疫反应不能清除HBV，所以开始人们对于接种rHBs治疗HBV感染抱怀疑态度。然而国外临床实验证实，给HBV感染者接种rHBs，通过提高抗HBV特异性细胞免疫反应，清除其体内的HBV，达到治疗HBV慢性肝炎的目的。法国Stanislas等教授对接种rHBs治疗HBV慢性肝炎进行了大范围、多中心、随机、对照研究：实验组HBV慢性肝炎患者接受5次20μg的rHBs皮下接种，发现与未接受治疗的对照组相比，实验组患者血清HBV DNA转阴率明显较高，特别是接种前血清HBV DNA含量高于200pg/ml的患者，其血清HBV DNA转阴率更高；实验组患者HBe/anti-HBe血清转换率为13.3%，而对照组只有3.6%。表明接种rHBs能够抑制HBV慢性肝炎患者体内HBV复制，降低体内HBV含量，证实接种rHBs能提高抗HBV特异性细胞免疫反应，确实能够治疗HBV感染。
HBV感染引起的免疫反应不能清除HBV，皮下接种较预防剂量高的rHBs能引起特异性细胞免疫反应，能用于治疗HBV感染，究其原因可能与以下原因有关：(1) 接种途径不同，研究证实，腹腔或皮下含有较多的抗原提呈细胞—树突状细胞(dentritic cell，DC)，而DC是目前已知的抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞，腹腔或皮下接种能引起较强的特异性细胞免疫反应。(2) 接种剂量不同，细胞免疫反应强度与接种剂量有关，腹腔或皮下接种较预防剂量高的rHBs能引起明显的特异性细胞免疫反应，小鼠0.125μg的接种剂量相当于人10μg的免疫预防接种剂量；Stanislas等教授采用的是给HBV患者5次20μg的rHBs皮下接种，而一般预防HBV感染，3次5～10μg的rHBs皮下接种就能得到满意的预防效果；笔者的研究也证实，接种rHBs的小鼠脾T淋巴细胞在体外再受rHBs刺激后，脾T淋巴细胞特异性CTL反应、IL-2、IFN-r的分泌是剂量依赖性的，加强免疫或增加接种剂量使脾T淋巴细胞特异性CTL反应、IL-2，IFN-r的分泌显著增加［10，11］。
笔者的研究发现，BALB/c小鼠腹腔接种rHBs后2周，其脾淋巴细胞即产生抗HBV特异性CTL反应并分泌Th1淋巴细胞因子，提示接种rHBs有助于提高HBV慢性感染者抗HBV特异性细胞免疫反应，有可能用于治疗已有的HBV感染，为治疗HBV感染提供了一种新的免疫治疗方法。
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