反义hTERT体外诱导肺癌细胞凋亡的研究
作者：尹为华，马雅，李若馨，孙来保
【摘要】 目的 研究反义hTERT基因体外诱导肺癌细胞凋亡。方法 体外通过SuperFect（QIAGEN）转染正、反义hTERT真核表达载体至人肺腺癌细胞株GLC-82，再经过G418及PCR筛选鉴定获得分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞GLC-82-s和GLC-82-as。然后采用MTT法、双层软琼脂克隆形成实验、流式细胞术观察和分析了反义hTERT对肺癌细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡；同时我们还运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行了检测。结果 当各组细胞传至第25代后，与GLC-82、GLC-82-s比较，GLC-82-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低，同时伴有凋亡率的显著增加；与空白对照、正义hTERT组相比，反义hTERT能显著地降低GLC-82细胞内源性hTERT mRNA的表达（P<0.01）和下调端粒酶活性。结论 反义hTERT体外确实能明显地诱导肺癌细胞的凋亡及抑制瘤细胞的生长增殖能力。
【关键词】 反义hTERT；肺癌；凋亡；细胞增殖；实时荧光定量RT-PCR
【Abstract】 Objective To study the cell apoptosis of lung cancer induced by antisense hTERT in vitro. Methods The sense and antisense hTERT eukaryotic expression vectors were transfected into lung cancer cell line GLC-82 using the SuperFect transfection reagent (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions， then the GLC-82-s and GLC-82-as of G418-resistant colonies were obtained with G418 and identified for the presence of hTERT insert by PCR with T7 and pcDNA3.1/BGH reverse primers. After that， MTT cellular proliferation assay， soft agar colony formation assay and flow cytometry were adopted to analyze if the proliferation capacity of lung cancer cell were effected in vitro and the tumor cells can be induced to apoptosis by antisense hTERT. Meanwhile， we have also detected the endogenous hTERT mRNA expression and telomerase activity by quantitative real-time RT-PCR and TRAP-silver staining assay in each group cells.Results After 25 passages of three group cells， a 7-day cell growth curve and the numbers (size) of soft agar colony formation showed the proliferation rates and the anchorage-independent growth ability in GLC-82-as were significantly decreased and reduced， compared with GLC-82 and GLC-82-s. But there was a significant increase in apoptosis percentage of GLC-82-as by flow cytometry， compared with control groups. Antisense hTERT can remarkably reduce the endogenous hTERT mRNA expression (P<0.01) and down-regulate telomerase activity in GLC-82， compared with blank control and sense hTERT groups.Conclusion Antisense hTERT can obviously induce cell apoptosis and inhibit growth/proliferation of lung cancer cell in vitro.
【Key words】 antisense hTERT；lung cancer；apoptosis；cell proliferation；quantitative real-time RT-PCR
端粒酶是一种RNA依赖的DNA多聚酶，其主要功能是补充合成端粒DNA；目前已证实端粒酶至少由两种主要成分构成：一种为从头合成端粒DNA提供模板的人端粒酶RNA（hTR）组份，另一为人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位（hTERT），后者才是其活性表达的关键组份和限速因子（rate-limiting factor）［1］。大量研究表明端粒酶的激活是肿瘤恶性转变的一个早期事件，与肿瘤的恶性程度成正相关［2，3］；同样肺癌及其细胞株也不例外地存在着端粒酶活性的高表达情况［2］，因此封闭和抑制端粒酶使其失活代表着一种恶性肿瘤分子生物的一种新的思路，且具有广谱、高效、低毒的应用前景。本研究旨在将靶向端粒酶蛋白亚基的反义hTERT基因真核表达载体转染肺癌细胞GLC-82，观察其对肺癌细胞体外诱导凋亡及增殖生长的抑制作用，为探索恶性肿瘤治疗新途径奠定实验基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α及HeLa宫颈癌细胞株、人肺腺癌细胞株GLC-82为本室冻存，pGEM○R-T载体为Promega公司产品，高效真核表达质粒pcDNA3.1(±)为Invitrogen公司产品，限制性内切酶BamH I、Xho I 为NEB公司产品。DNA Ligation Kit 为TaKaRa产品。Advantage-GC 2 PCR Kit为Clontech公司产品。G418购自上海Sangon，MTT为美国Amresco产品。其余的所需分子生物学试剂均为Qiagen公司产品。
1.2 正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定 参见［4］方法。
1.3 细胞培养 体外常规培养GLC-82人肺腺癌细胞，培养液为RPMI 1640（Gibco/BRL）＋10%胎牛血清（HyClone）＋双抗100u/ml；在含5%CO2，饱和湿度，37℃培养箱中培养。转染后筛选培养液为RPMI 1640＋10%胎牛血清＋300μg/ml G418。
1.4 转染及筛选 参见文献［5］进行。实验分成3组：a 空白对照组，b 正义hTERT组，c 反义hTERT组。最后将正、反义hTERT组获得的G418抗性克隆扩大培养，并将PCR鉴定结果分别命名为GLC-82-s、GLC-82-as。
1.5 细胞凋亡的检测 采用Annexin V-FITC/PI（Pharmingen）双染色法，操作方法按试剂说明书进行，检测用仪器为美国COULTER EPICS○R ALTRA流式细胞仪。
1.6 细胞增殖生长能力的测定 GLC-82、GLC-82-s及GLC-82-as 3组细胞7日生长曲线的绘制系采用MTT法并文献［7］进行，酶标仪为Bio-Rad Model 550。双层软琼脂克隆形成实验参考文献［6］方法。
1.7 实时荧光定量RT-PCR对hTERT表达水平的检测 具体方法参考文献［7］。所采用的试剂为罗氏LightCycler TeloTAGGG hTERT Quantification Kit，使用仪器为罗氏LightCycler荧光定量PCR仪。
1.8 端粒酶活性测定 采用非放射性TRAP-银染法，按参考文献［8］进行。
1.9 统计学方法 采用SPSS软件10.0版分析。
2 结果
2.1 正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定 参见文献［4］。
2.2 正、反义hTERT组G418抗性克隆是否转入重组体的筛选鉴定 常规提取细胞DNA后采用位于pcDNA3.1质粒载体多克隆位点两侧的T7及pcDNA3.1/BGH反向引物进行PCR扩增外源性基因片段，结果见图1。GLC-82-s、GLC-82-as G418抗性克隆均可见一条大小约340bp的特异性条带，而空白对照组则未见，说明GLC-82人肺腺癌细胞已被成功地转入了正、反义hTERT外源重组体。
图1 G418抗性克隆外源基因片段的PCR扩增结果
M：100bp ladder Marker；1：GLC-82；
2：GLC-82-s；3：GLC-82-as
2.3 反义hTERT诱导肺癌细胞凋亡 为了阐明反义hTERT是否通过诱导肿瘤细胞的凋亡途径来抑制肿瘤增殖的，我们分别取GLC-82、GLC-82-s及GLC-82-as 3组传至第5、25代的细胞来检测，结果见图2。在第5代时检测结果显示各组间差异无显著性（资料未显示）。图2 3组细胞第25代之凋亡百分率 第25代时GLC-82-as的凋亡率较GLC-82、GLC-82-s细胞克隆有显著性增加（P<0.05)。
图2 3组细胞第25代之凋亡百分率
2.4 反义hTERT对肺癌细胞体外增殖生长的抑制作用 分别取GLC-82、GLC-82-s及GLC-82-as 3组传至第25代的细胞来绘制7日生长曲线，结果见图3。从图3观察GLC-82-as细胞增殖速度较GLC-82、GLC-82-s细胞明显减低，以后4天尤为显著（P<0.01）。另外双层软琼脂克隆形成实验亦是用3组传至第25代的细胞来进行的，结果显示GLC-82-as细胞无论在集落形成的数量或是大小上均较GLC-82、GLC-82-s 2组细胞明显减少、变小，差异有显著性（P<0.01）。分别是：GLC-82-as为25.3±3.8，GLC-82-s为112.53±6.02， GLC-82为126.33±8.06。
图3 3组细胞第25代之7日生长曲线
2.5 反义hTERT对端粒酶蛋白亚单位基因表达的影响 为了更精确地反映我们自行构建的反义hTERT真核表达载体对肺癌细胞端粒酶蛋白亚单位基因表达的靶向封闭及抑制效果，采用了LightCycler实时荧光定量RT-PCR技术对各组细胞经转染后内源性hTERT mRNA表达量的实际变化情况进行了检测，结果见表1。正义hTERT组与空白对照组间差异无显著性，反义组hTERT mRNA表达量则见明显下降，与空白对照组间差异有非常显著性（P<0.01）。
表1 各组hTERT mRNA表达的实时荧光定量PCR检测结果 （x±s）
注：与空白对照组比较，*P＞0.05，**P<0.01
2.6 反义hTERT对肺癌细胞端粒酶活性的影响 分别收集GLC-82、GLC-82-s、GLC-82-as各组细胞，并采用非放射性TRAP-银染法对其端粒酶的活性进行了检测，结果显示反义hTERT组的端粒酶活性（PCR产物梯度条带）较空白对照组、正义hTERT组明显降低（减少），这与上述反义hTERT组能显著下调内源性hTERT mRNA表达量的结果相一致。
3 讨论
肺癌乃当今世人公认的危害人类生命健康的常见多发病和导致死亡的主要原因之一，尽管传统手术及放化疗技术不断提高和，但对患者的治愈率仍不理想。近年来大量的研究发现端粒酶在约98%永生细胞株和90%以上的恶性肿瘤组织中表达，正常周边组织细胞却少有表达［1～3］，而且hTERT蛋白亚基组份才是其活性表达的决定因素［3］。本研究正是基于这些发现首先采用分子克隆技术，成功地构建了能特异靶向封闭对启动内源性hTERT基因表达起关键作用的起始密码子前后一段序列的反义hTERT真核表达载体［4］，为进一步研究其分子生物恶性肿瘤提供了实验材料。
为了探讨反义hTERT体外诱导肺癌细胞凋亡及增殖生长特性的改变和影响，我们采用了流式细胞术、MTT法、双层软琼脂克隆形成实验分别对各组传至第5、25代的细胞进行了观察和分析。结果与空白对照、正义hTERT组比较，传至第25代的反义hTERT组细胞无论在生长速度还是在集落形成的数目、大小上均明显地减慢和降低，同时凋亡率显著地增加；但传至第5代的细胞进行同样的检测实验结果却未见明显改变（资料未显示）。究其原因这可能与GLC-82肺癌细胞的染色体末端的起始端粒长度有关，只有当端粒缩短到一定长度才引发细胞衰亡［9］；因此尽管转入了反义hTERT重组体的肺癌细胞内在的端粒酶活性能很快地被抑制并且不能再添加端粒重复序列，但细胞的起始端粒长度在此却起了缓冲作用。因此本研究构建的反义hTERT其潜在广谱的抗肿瘤分子生物治疗机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达（端粒酶活性）而最终引发瘤细胞走向凋亡的途径来实现的。
为了验证上述设想，我们使用自行构建的反义hTERT真核表达载体观察分析了对肺癌细胞内源性hTERT mRNA表达的靶向封闭及抑制效果，采用了LightCycler实时荧光定量RT-PCR技术对转染GLC-82肺癌细胞前后的内源性hTERT mRNA表达量的实际变化情况进行了检测，结果表明正义hTERT组与空白对照组间差异无显著性，反义组hTERT mRNA表达量则见明显下降，与空白对照组间差异有显著性（P<0.01）。同时还运用我们以前建立的简便快速、敏感而有效的非放射性TRAP-银染法［8］对转染前后各组的端粒酶活性进行了检测，结果显示反义hTERT组的端粒酶活性（PCR产物梯度条带）较空白对照组、空载体组明显降低（减少）。以上的研究结果强烈提示我们自行构建的反义hTERT真核表达载体确实能明显有效地封闭和抑制hTERT mRNA的表达和下调端粒酶的活性，其在抗肿瘤靶向分子生物治疗中有着高度特异性和潜在应用的广谱性。
【】
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4 孙来保，李成荣，文剑明，等．正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定．第一军医大学学报，2003，23(9)：899-902．
5 孙来保，李成荣，文剑明，等．反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用．中华病杂志，2004，33(5)：454-457．
6 程宝鸾．动物细胞培养技术．广州：华南理工大学出版社，2001，124-132．
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