血清HBV-DNA与HBV免疫学标志物之间的相关性研究
【关键词】 HBV-DNA；Real-time PCR；ELISA；HBV-M；HBV-PreS1
【Abstract】 Objective To study the relationship between serum HBV-DNA and six types immune markers for hepatitis B virus (HBV-M).Methods Serum HBV-DNA was determined by real-time PCR assay while the six types HBV-M by ELISA method.Results Of 88 patients positive for HBsAg，HBeAg and HBcAb，the HBV-PreS1 positive rate was 68.18%，and the HBV-DNA positive rate was 96.59%.Of 144 patients positive for HBsAg，HBeAb and HBcAb，the HBV-PreS1 positive rate was 56.94%，and the HBV-DNA positive rate was 50.69%.Of 36 patients positive for HBsAg and HBcAb，the HBV-PreS1 positive rate was 55.56%，and the HBV-DNA positive rate was 63.89%.Of 41 patients positive for HBsAb，the HBV-PreS1 positive rate was 0，and the HBV-DNA positive rate was 26.83%.Of 17 patients negative for the HBV-M，the HBV-PreS1 positive rate was 0，and the HBV-DNA positive rate was 11.76%.The results of HBV-DNA fluorogenic quantitative PCR were significantly correlated with the positive models Ⅰ，ⅡandⅢ of HBV(P<0.05)，and the positive rates of HBV-DNA fluorogenic quantitative PCR were significantly higher than the rates of positive models Ⅰ，Ⅱand Ⅲ of HBV(P<0.05).Conclusion There was a positive good correlation between carrying capacity of serum HBV-DNA and the antigens content.Serum HBV-DNA determination can be used to monitor the true state of HBV infection and replication，and it is useful for judging effectiveness of anti-virus treatment.
乙型肝炎病毒（HBV）是乙型肝炎的病原体，HBV感染的诊断指标主要有HBV-DNA和血清标志物HBV-M（即乙肝六项免疫标志物:HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBV-PreS1）等。本文对以上标志物进行检测分析，以探讨血清HBV-DNA与免疫标志物的相关性、符合性和补充性，从而进一步证实HBV-DNA检测在乙肝早期诊断、传染性识别、病毒复制水平判断以及抗病毒效果监测中的地位和价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源 2004年5月25日～9月17日收集的在大坪就诊的病人血清样本344份。
1.2 试剂与方法
1.2.1 HBV-DNA检测 采用Real-time PCR法检测，试剂盒由深圳匹基生物工程股份有限公司提供，扩增仪为美国BIO-RAD公司生产的Icycler Real-time PCR扩增仪，检测方法严格按照试剂盒说明书操作。
1.2.2 HBV?M检测 采用ELISA法检测，试剂盒由中国兰州标佳生物技术有限公司提供，采用意大利AMP全自动酶免分析仪进行检测，检测方法严格按照试剂盒说明书操作。
1.2.3 HBV感染临床诊断标准 （1）HBsAg阳性＞6个月；（2）血清HBV-DNA＞105copies/ml；（3）持续或间歇的ALT/AST水平升高；（4）肝活组织检查显示慢性肝炎（坏死炎症Knodell积分≥4分）（可选项）。
2 结果
344份病人血清标本同时做免疫标志物及HBV-DNA检测，HBV五项免疫学标志物出现11种组合，与HBV-PreS1、血清HBV-DNA阳性结果的比较，见表1。
表1 HBV的ELISA阳性模式与荧光定量PCR结果 份（%）
3 讨论
3.1 HBV的ELISA阳性模式Ⅰ与荧光定量PCR结果 见表2。
3.1.1 独立性检验 χ2=11085.28，P＜0.05。HBV的ELISA阳性模式Ⅰ与荧光定量PCR结果之间存在关联性。
3.1.2 差异性检验 χ2=105.41，P＜0.05。HBV的ELISA阳性模式Ⅰ与荧光定量PCR结果之间存在差异性，荧光定量PCR结果阳性率高于HBV的ELISA阳性模式Ⅰ，血清HBV-DNA平均含量为3.76×108copies/ml，见表2。
表2 HBV的ELISA阳性模式Ⅰ与荧光定量PCR结果 （份）
88例HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性患者血清HBV-DNA的阳性率高达96.59%，血清HBV-DNA平均含量为3.76×108copies/ml。独立性检验提示ELISA阳性模式Ⅰ与荧光定量PCR的结果是相互关联的，二者具有相似的流行病学意义，同时，差异性检验也反映了荧光定量PCR结果阳性率更高，更能直接体现HBV的复制程度。
3.2.1 独立性检验 χ2=105.75，P＜0.05。HBV的ELISA阳性模式Ⅱ与荧光定量PCR结果之间存在关联性。
3.2.2 差异性检验 χ2=15.76，P＜0.05。HBV的ELISA阳性模式Ⅱ与荧光定量PCR结果之间存在差异性，荧光定量PCR结果阳性率高于HBV的ELISA阳性模式Ⅱ，血清HBV-DNA平均含量为8.63×104copies/ml，见表3。
表3 HBV的ELISA阳性模式Ⅱ与荧光定量PCR结果 （份）
144例HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性患者血清HBV-DNA的阳性率高达50.69%，血清HBV-DNA平均含量为8.63×104copies/ml。随着HBeAg消失、HBeAb的出现，荧光定量PCR的阳性率、HBV-DNA的拷贝数均降低，说明HBeAb出现后，病毒的复制减弱，传染性减低，但并非HBeAb阳性血清中就没有HBV，应当重视HBeAb阳性的产生与HBV病毒的消失是一个动态过程［1］。独立性检验提示ELISA阳性模式Ⅱ与荧光定量PCR的结果是相互关联的，同时，差异性检验也反映了荧光定量PCR结果阳性率更高，HBV-DNA较HBV-M特异性更强、敏感性更高，更能直接反映HBV-DNA的复制。
3.3 HBV的ELISA阳性模式Ⅲ与荧光定量PCR结果 见表4。
3.3.1 独立性检验 χ2=22.72，P＜0.05。HBV的ELISA阳性模式Ⅲ与荧光定量PCR结果之间存在关联性。
3.3.2 差异性检验 χ2=140.82，P＜0.05。HBV的ELISA阳性模式Ⅲ与荧光定量PCR结果之间存在差异性，荧光定量PCR结果阳性率高于HBV的ELISA阳性模式Ⅲ，血清HBV-DNA平均含量为4.84×107copies/ml，见表4。
表4 HBV的ELISA阳性模式Ⅲ与荧光定量PCR结果 （份）
36例HBsAg、HBcAb阳性患者血清HBV-DNA的阳性率高达63.89%，血清HBV-DNA平均含量为4.84×107copies/ml，这与［2］报道HBeAg阴性的患者仍有半数以上可检出HBV-DNA是一致的。说明HBeAg与HBV-DNA的变化并不一致，因此不能仅以ELISA法测定血清HBeAg阴性就确定HBV在体内无复制现象，而要以敏感性较高的荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量水平，才能更确切地判断HBV复制状况。独立性检验提示ELISA阳性模式Ⅲ与荧光定量PCR的结果是相互关联的，同时，差异性检验也反映了荧光定量PCR结果阳性率更高，更能直接体现HBV的复制程度。
3.4 HBV的ELISA阳性模式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与荧光定量PCR结果独立性检验、差异性检验统计 见表5。
表5 独立性检验和差异性检验结果统计
人体感染HBV后易转为慢性乙型肝炎，感染过程分为3个连续阶段，即免疫耐受期（高复制水平HBeAg和HBV-DNA）、免疫清除期（中等或低复制水平HBeAg和HBV-DNA）与残余整合期（无HBeAg和HBV-DNA）［3］。值得注意的是，HBeAg的产生，增加转阳，进而减少、消失、转阴；以及HBeAb的产生，进而增加转阳，与HBV病毒的消失是一个动态过程。与此相似的还有HBV-PreS1，其转阴时仍有一定数量HBV-DNA存在，临床仍需注意动态观察效果［4］。由此可见，HBV感染人体是一个连续的、动态的过程，HBV-M虽可在一定程度上反映病毒是否处于复制状态，但是不可避免地具有一定的局限性。而荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量水平，能直接体现HBV复制程度，敏感性更强，特异性更高，在乙肝早期诊断、传染性识别、病毒复制水平判断以及动态观察治疗效果中具有更高的地位和价值。
【文献】
1 赵颖，卢银红，杨宝珍，等.HBV?DNA与HBV?M关系的研究.宁夏医学杂志，2004，26（2）：88-89.
2 王添章，张宜俊，刘树人，等.慢性HBV感染者血清中HBV?DNA与HBeAg量的关系及其临床意义.检验医学，2004，19（1）：71-72.
3 蒋冬香，陈刚.HBV感染者HBV-DNA与血清标记物间的关系.实用肝脏病杂志，2004，7（4）：217.
4 陈如昌.乙肝病毒PreS1与HBV-DNA检测的关系.浙江临床医学，2004，6（1）：65.
