西藏地区的主要乙肝病毒基因型CD杂交型

　［摘要］虽然在西藏高原地区有着大量的乙肝表面杭原阳性的群体，但是目前还未见报道来自这一地区的乙肝病毒（HBV）的DNA序列。因此我们将对26例乙肝表面杭原阳性的藏民血清中分离到的乙肝病毒进行定性研究。为了确定HBV的基因型及它的多基因联系，我们对两个基因部位进行了测序，其中一个包括preSl/preS2/S部位，另一个包括preC/C部位，并基于所处部位的不同而分为两种不同的基因型。为了更明确这一发现，我们又对代表不同组别的HBV基因组进行了测序，结果表明存在于西藏的HBV属于C基因型，而在C基因型中至少存在两种亚群，一为占多数的亚群为C/D杂交型，其血清型为ayw，另一为C基因型，其血清型为adw。本文首次报道来自西藏的HBV的全部核普酸序列，这一结果将有助于全球的关于重组HBV的研究，并促进来自这一地区的HBV的基因型及基因重组的探索。

　　引言：
　　虽然在世界的80多个国家已经加强了使用乙肝表面抗原疫苗及众多的免疫措施，HBV感染仍是一个主要危害公众健康的问题。目前在全世界范围内有约3亿5千万慢性携带者，其中约10％可能死于继发的肝硬化和肝细胞癌（Kane，1996）。过去20年的分子流行病学研究将HBVDNA序列分为7种基因型，A－G（Okamoto et al.，1986；Norder et al.，1992；Norder et al.， 1994；Stuyver et al.，2000）。HBV基因型的界定是基于以下定义：组别之间的全部基因组核昔酸序列的差别不低于8％，或表面基因的差别不低于4.1％（Okamoto et al.，1988；Norder et al.，1994；）。基因组的分布也表现出地理位置的特点，基因型A广泛分布于世界范围；基因型B和C主要见于亚洲；基因型D在欧洲南部、美洲和澳洲；基因型E主要见于非洲；基因型F发现于印地安人和玻利维亚人，而基因型G则主要在美国和欧洲（Stuyver et al.，2001）。在流行的HBV主要是基因型B和C（Zhu et al.，1999）。此外也观察到重组的基因型。多基因分析表明B/C重组体广泛存在于亚洲东部，A/ D重组体存在于意大利（Morozov et al.，2000）。
　　在西藏，有26.2％的人群为乙肝表面抗原阳性（Luo et al.，1993）。但是目前未见关于HBV的研究报道。未发现的基因型有可能在HBV的高感染率中起着重要的作用。通过对来自这一地区的HBV进行测序及多基因分析，我们发现西藏的主要的HBV基因型为C/D杂交型。
　　材料与方法：
　　研究对象：1000多份乙肝表面抗原阳性的血清样本，采自西藏自治区的主要城市（拉萨、日喀则、山南、那曲）无临床症状的HBV感染的中学生。这些学生均未观察到肝功能异常。所有的研究对象均为西藏人。26例样本乃随机抽取。在这26例分析样本的平均年龄为14.8岁。
　　HBVDNA的提纯和扩增：血清样本在－80（C中储存待测。病毒DNA提取自50（1含NP－40和0.75％的Tween－20的血清裂解液。对应于裂解基因组包括preC/C基因的1746nt到2502nt（片段A）及包括presl/preS2/S基因的2798nt到861nt的两个片段（片段B）进行PCR。片段A使用引物CH和CR1进行扩增，再用引物CF2和CR1进行半巢式反应。两种HBV的全部基因组使用表1中所列的引物进行扩增。扩增过程为：30（1反应液中加入2（1DNA，94（C lmin 35个循环，58（Clmin，72（Clmin。在PCR的每个过程均按常规避免污染，并且每次扩增均设阴性对照。
　　测序：PCR产物经过Resin纯化后，使用引物、大染料末端循环测序反应试剂盒进行双向测序。片段B的PCR产物为1200bp，除了扩增引物SF和SR被用来测序外，还设计了内部测序引物SS。测序在自动DNA测序仪AB1377上进行。
　　数据分析：
　　西藏HBV的核昔酸序列与来自与基因库中的23例HBV进行比较，它们分别代表6种基因型，A-F。多基因树在MEGA2.1版本，使用木村双参数基质和邻居连接方法构建而成。为了验证多基因树分析的可靠性，重新采样和重新构建重复了500次。重组是采用S1mPlot（Lole et al.，1999）和Boots扫描进行研究。
　　（http：//www.welch.jhu.edu/sray）。
　　结果和讨论：
　　重组基因型在西藏占优势和重组发生的部位：随机抽取的26例DNA的片段A和片段B进行扩增和测序。片段A中的差异为0.00％－2.53％，片段B中的为0.00％－1.67％除了一份除外，它们与其它类型的差异为5.57％－6.90％。因为不同部位的HBV的序列彼此呈高度同源，因此有可能在西藏存在特殊的HBV基因型。得到的Tibet705归类于不同基因型。
　　使用26例序列和来自于23例基因库中全部HBV核着酸序列的相关部位，我们基于表面基因的片段B和核心基因的片段A的两个多基因树（图la，lb）。HBV序列的表面基因在树中的基因型D中集聚，除了Tibet705集聚在基因型C。但是核心基因全部集聚于基因型C。因此多基因树表明存在于西藏的未知重组基因。
　　代表了两组的Tibet127和Tibet705的全部基因组被测序（图中，AY057948，AY057947），Tibet127和Tibet705长度均为3215bp。多基因分析将两个病毒基因组归入基因型C（图1c），虽然Tibet127的表面基因更接近基因型D，而不是基因型C。全部基因组和每个HBV　ORFs与Tibet127和Tibet705及先期报道的基因型也进行了比较（表2）。
　　Simplot和boots扫描被用来分析Tibet127的可能重组。结果表明Tibet127preS2/S基因和部分P基因是基因型D（图2），而其它的病毒基因组是基因型C。如图2显示重组部位约在nt50nt1450部位。与此相应，基于nt51－1450的多基因树，Tibet127属于基因型D；而基于nt1456－50的基因树，却集聚于基因型C（表3b）。

　　大量的证据表明病毒间的重组是相对频繁的事件（Georgi－Geisberger et al.，1992；Bollyky et al.，1996；Morozov et al. ，2000；Bowyer & Sim，2000； Hannoun et al.，2000；Sugauchi et al. ，2001）。虽然其机制尚不明了，但目前的发现支持随机机制。通过分析包含基因型A的基因型D的HBV和包含基因型C的基因型B膜块序列，发现三个重组部位在DRl核心区的3’端和S基因的3’端（Morozo et al.，2000；Bowyer & Sim，2000）。在其它的报告中，发现来自于越南的HBV基因型为基因型A和基因型C的重组体（Hannoun et al.，2000）：来自于澳洲土著的HBV，其全部基因组接近基因型C（6.9％），但是S基因却与同型存在较大差异。在本研究中的CID杂交型与所有的报告的重组体均不同。而且这一重组体的重组部位在nt50和1450nt，与其它的部位不同，有可能是早期重组事件的产物。它有可能是HBV在西藏的有趣特性，并提示重组机制有可能比我们想象的更复杂。
　　在西藏的96％的HBV是C/D重组。基因型C是在汉族中占多数的基因型，但是基因型D却主要见于地中海地区。是否这一重组体是适应于高原的特殊环境和特殊的藏族人群的基因背景还待于大量的研究。从西藏和它的临近地区的基因研究将有助于探讨C/D重组型的可能根源，同时将了解重组病毒在病因学上的差异。
　　西藏HBV的血清学分析：氨基酸残基d/y和w/r分别特定在乙肝表面抗原的氨基酸位点122和160（Okamoto et al.，1988）。通过比较覆盖这一部位乙肝表面抗原101－180残基，25例HBV表现为ayw2除了Tibet705，它为adw，因为nt633的G－A的转换而出现的（Fig4），122位的丝氨酸、160位的丝氨酸、只见于160位的不同的adrq＋。 HBV的血清型与以前报道的在西藏大量存在的血清型ayw相一致（Luo et al.，1993）。
　　大多数ayw血清型属于基因型D和基因型B。但是我们的研究表明来自于藏族人的ayw血清型属于基因型C，可能是由于基因型C和基因型D之间发生了重组。
　　结论：
　　我们首次报道了乙肝表面抗原阳性的藏族人HBV的全部基因组序列，表明西藏地区主要存在的HBV基因型为C/D重组病毒。这些结果可能为病毒重组的多基因来源提供可靠的信息，也将有助于推进从病毒基因型向疫苗效果和临床意义的转化，及探明高原地区高HBV感染率的原因。