AB-8大孔吸附树脂分离小叶榕叶水提物中黄酮类化合物的研究

                 作者：冯丹丹，王立升，刘力恒，龚福忠，李鑫

【摘要】  目的考察AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶水提物黄酮的吸附解吸性能。方法采用树脂柱进行动态吸附和解吸小叶榕叶水提物中的黄酮类化合物，用紫外-可见分光光度法测吸光度，得出吸附率和解吸率。结果AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶水提物黄酮有较高的吸附率和解吸率，能达到分离纯化的目的。结论AB-8能有效富集小叶榕叶中黄酮类化合物，适用于分离纯化小叶榕叶浸膏以提高其有效成分。

【关键词】  小叶榕；黄酮；大孔吸附树脂；动态吸附；动态解吸

　　Abstract：ObjectiveTo study the absorption and desorption quantity of AB-8 Macroporous Resin with flavones in aqueous extracts of Ficus microcarpa L.f.MethodsUsing spectrophotometry to check absorbance of sample which dynamic absorb and desorb flavones in aqueous extracts of Ficus microcarpa L. f. by resin column to get the aborption rate and desorption rate.ResultsAB-8 Macroporous Resin which has preferable absorption and desorption capacity for flavonoids in aqueous extracts of Ficus microcarpa L.f. coud be used to purity the extracts.ConclusionAB-8 Resin has the capability of enriching flavonoids in Ficus microcarpa L.f. validitily. It is feasible to applies AB-8 Resin to raise compositions of Ficus microcarpa L.f.

　　Key words：Ficus microcarpa L.f.;   Flavonoids;   Macroporous resin ;  Dynamic absorbing;   Dynamic desorption

    小叶榕Ficus microcarpa L.f.为桑科植物榕树，异名落地金线，是热带雨林中的关键种类。我国榕属植物约一百种，主要分布在福建、广东、广西、海南、台湾和浙江等地。研究表明小叶榕叶中主要含黄酮、三萜类、齐墩果酸、脂肪族化合物和甾体化合物等［1］。其中黄酮类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品。已正式上市的部颁标准中哮喘和慢性支气管炎治疗药咳特灵胶囊就是以小叶榕叶浸膏作为主成分的［2～4］。

    大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，富集效果好,解吸条件温和，再生简便，使用周期长等优点，因此，近年来，树脂吸附法得到了长足的发展，被广泛应用于天然产物的分离纯化［5～11］。郭菁等［12］考察了AB-8树脂对红花桑寄生总黄酮的饱和吸附量可达29.0 mg/g，动态洗脱率达95.0%，获得产品中黄酮纯度为46.0%，得率为5.5%。林秋凤等［13］研究了AB-8大孔吸附树脂对金莲花总黄酮的吸附和解吸特性，纯化后的总黄酮纯度为38.9%，比粗提物的总黄酮纯度提高了2.88倍，纯化能力与聚酰胺相当。目前国内外对小叶榕叶总黄酮提取分离的报道较多，但都是采用石油醚、乙醇、水等溶剂直接浸提或辅以超声波提取［14～18］，未见有使用大孔吸附树脂进行纯化的报道。本文以小叶榕叶水提物为原料液，选择对植物黄酮类化合物有较好吸附选择性的AB-8大孔吸附树脂［19～24］，通过对小叶榕叶水提物黄酮的动态吸附和动态解吸研究，发现AB-8 吸附树脂能有效提高小叶榕叶水提物浸膏的黄酮含量，是一种性能优良、价格低廉、可实现工业化生产的吸附剂。

　　1  材料与仪器

    小叶榕叶水提物浸膏，购于广西南宁市内。标准品芦丁，南京青泽医药科技开发有限公司（批号：20060211）；其他试剂均为分析纯；AB-8大孔吸附树脂  天津南开大学化工厂。2550紫外可见分光光度计（日本岛津）；RE-52C 旋转蒸发仪；BQ50-1J/WX10恒流泵（保定兰格恒流泵有限公司）；分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 AL204］。

　　2 方法

　　2.1  树脂的预处理［25～27］将新树脂加水浸泡24 h，用砂芯柱进行反洗，除掉小颗粒树脂。先用乙醇浸泡充分溶胀，然后用乙醇洗至流出液加适量水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗尽醇味，最后转入酸碱处理。即用5%HCl浸泡4 h，滤过后蒸馏水洗至近中性。再用4%NaOH浸泡4 h，滤过后蒸馏水洗至近中性。最后用含4%NaCl和4%NaCO3的混合溶液浸泡4 h，用蒸馏水反复清洗至中性，备用。

　　2.2  吸附树脂的物理性能树脂吸附性能的优劣是由其化学和物理结构所决定的，AB-8大孔吸附树脂的结构性能见表1。表1  吸附树脂的物理性能（略）

　　2.3  供试液的制备称取小叶榕叶水提取物550.1 g（含水量为35.60%）,加8 869 ml蒸馏水溶解,静置4 h以上，减压抽滤，滤液收集备用。

　　2.4  检测方法

　　［28］称取芦丁标准品20.1 mg，用60% 乙醇溶解并定容于500 ml容量瓶中, 摇匀得浓度为40.2 μg/ml的芦丁标准溶液，备用。分别精取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml芦丁标准溶液于8只25 ml容量瓶中，各加入0.5 mol/L NaNO2溶液1.0 ml，混匀，放置6 min后加入0.3 mol/LAlCl3溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加入1 mol/L NaOH 溶液5 ml，用60%乙醇稀释至刻度，以芦丁标准品为参比，于波长500 nm处比色测定各吸光度。其结果见图1 。

    数据用最小二乘法进行线性回归，得芦丁溶液Y与吸光度值X 的关系曲线的回归方程式：Y=0.010 9X+0.000 3，r=0.999 4。用同种方法，相同条件下测定各样品的吸光度，由对应的吸光度标准曲线查出相应浓度，并计算样品黄酮浓度。

　　2.5  AB-8大孔吸附树脂的吸附性能和解吸性能测定

　　2.5.1  树脂的吸附量和吸附率测定

　　［29］测定方法为：准确称取经预处理的树脂各10 g (湿)， 含水量均为76.67%，装入30 cm×1.5 cm玻璃柱中，控制上样流速为2.60 ml/min,柱底活塞全打开，过柱液流速与上样液流速一致，收集过柱液，重吸附1次使样品液得以与树脂充分接触，测定最后过柱液中黄酮浓度，按下式计算树脂室温下的吸附量(mg/g)。
   
　　Q=（Co-Cr）×V/W

    式中：Q为吸附量(mg/g)，C0为上样液黄酮浓度(mg/ml)，Cr为过柱液黄酮浓度(mg/ml)，V 为溶液体积(ml)，W为树脂重量(g)。

    按下式计算树脂室温下的吸附率（%）。

    q （%）= (C0－Cr) / C0×100%

    式中：q为吸附率(%)，C0为上样液黄酮浓度(mg/ml)，Cr为过柱液黄酮浓度(mg/ml)。

　　2.5.2  树脂的解吸率测定按“2.5.1”方法对充分吸附后的树脂，控制流速为2.60 ml/min，分别用蒸馏水冲洗至流出液清亮，再用50%乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，测定醇洗脱液中黄酮浓度，并根据吸附量计算室温下的解吸率(%)。
   
　　树脂解吸率( % )= ［ C2/ ( C0－C1) ］×100%

    式中：C0为上样液黄酮浓度(mg/ml)，C1为过柱液黄酮浓度(mg/ml) C2为洗脱液黄酮浓度(mg/ml)。

　　2.6  AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶黄酮的动态吸附实验对AB-8大孔吸附树脂进行洗脱流速、上样液的pH 值、上样浓度、解吸流速、解吸液pH以及洗脱剂的浓度、用量等进行动态吸附实验，将预处理好的树脂装入1.5 cm×30 cm玻璃层析柱中，将已制备好的供试液按一定比例稀释后作为上样原液上柱，控制一定流速，分步收集过柱液，当流出液黄酮浓度达泄漏点即上样液的2/3 时，认为已透过，停止上样，计算吸附量。
   
　　吸附量= 上样液浓度(mg/ ml) ×流出液体积(ml)

　　3  结果

　　3.1  AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶黄酮的动态吸附结果［10，11］

　　3.1.1  流速的影响样品溶液通过树脂的流速对工作效率及其有效成分的吸附均有较大影响。通过调节恒流泵的流速对上柱溶液进行吸附流速的选择，应以泄漏点最迟出现的吸附流速为宜［19］。因此在样液黄酮浓度均为3.901 4 mg/ml，样液体积均为100 ml的条件下，控制流速分别为1.17，2.60，3.30，4.60，5.28 ml/min 进行动态吸附。5种吸附流速下的泄漏情况见图2 所示。

    通过计算可知，若流速为1.17 ml/min 时，泄漏点出现在80 ml附近，若流速为2.60 ml/min时，泄漏点出现在55 ml附近，若流速为3.30 ml/min 时，泄漏点出现在45 ml附近，若流速为4.60 ml/min 时，泄漏点出现在30 ml附近，若流速为5.28 ml/min 时，泄漏点出现在20 ml附近。流速为1.17 ml/min 时，虽然泄漏点出现的最迟，但导致循环周期延长。另对吸附树脂而言，不仅要求其吸附性能良好，还要追求其良好的洗脱性能，单一吸附泄漏点的后移，并不代表洗脱的效果也很好，洗脱效果是决定最佳吸附条件的另一关键。综合考虑吸附效果及生产周期，建议采用上样流速为2.60 ml/min进行吸附。

　　3.1.2  样品液pH 值的影响提取液的pH值是影响树脂纯化效果的重要因素，其基本原理是中药有效成分在不同pH值条件下溶解性能不同，因而易于吸附或解吸。在样液浓度均为2.9477 mg/ml,样液体积均为40ml的条件下，用酸或碱将稀释后的小叶榕叶供试液调成不同的pH值2，3，4，5，6，7，在吸附流速为2.60 ml/min时，分别对其泄漏情况进行比较。结果见图3。

    通过计算可知，6种条件下的泄漏点分别为30，25，20，18，16，14 ml。可见，AB-8 对供试液有较大的吸附量。从吸附量上考虑，pH=5.0 的条件下进行吸附比较适宜。这是由于黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，因而，要达到较好的吸附效果，必须在弱酸性条件下吸附。

　　3.1.3  上样浓度的影响原液浓度也是影响吸附的重要因素，如果原液浓度过低提纯时间增加，效率降低；原液浓度过高则泄漏早，处理量小，树脂的再生周期短。各取小叶榕叶水提物供试液34，50，67，83 ml，分别加水定容至100 ml容量瓶中，配成小叶榕叶水提物可溶物浓度为10，15，20，25，30 mg/ml的上样液，以乙=2.60 ml/min的流速流过玻璃层析柱，重吸附1次，收集过柱液，测定流出液黄酮浓度，计算吸附量。结果见图4。

    由图4可知，随着上样液浓度的增加，树脂吸附量相应增加，考虑生产成本及最佳吸附效果，取上样浓度为15 mg/ml为宜。