艾炷灸对D-半乳糖衰老小鼠大脑组织形态和超微结构的影响

　　3  结果

　　3.1  D-半乳糖衰老小鼠脑组织病理形态学改变脑组织常规石蜡切片，HE染色后，神经细胞胞浆呈紫红色，核呈紫蓝色。①生理组皮层脑细胞结构正常，胞核清晰，胞浆丰富，间质无水肿表现，海马CA3区锥体细胞2～3层，排列紧密，细胞核圆而大，核仁清晰(见图1～2)。模型组、自衰组可见皮层变薄，部分神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限模糊，核固缩成三角形或不规则形，核仁消失。海马CA3区锥体细胞层数减少，排列稀疏、不规则，细胞体积变小，可见核固缩现象（见图3～6）。艾灸1组、艾灸2组、电针组和尼莫地平组仍有不同程度的神经细胞变性，但变性神经细胞数量显著减少，零星可见部分损伤细胞，海马CA3区锥体细胞层细胞形态、排列基本正常（见图7～14）。②经单因素方差分析组间比较各组小鼠脑皮质及海马CA3区正常神经细胞的数目差异有显著性意义（P<0.01），并作组间两两比较。（见表1）。生理组、艾灸1组、艾灸2组、电针组、尼莫地平组与模型组、自然衰老组神经元密度比较差异有显著性意义（P<0.01），模型组神经元细胞密度下降。自然衰老小鼠大脑皮质神经元密度与模型组无差异，但在海马CA3区自然衰老组神经元密度较模型组减少明显，差异有显著性意义（P<0.05），提示模型组脑组织形态改变与自然衰老小鼠相似。生理组、艾灸组、电针组之间神经元密度无差异，尼莫地平组与前3组比较在皮质区神经元密度差异有显著性意义（P<0.01或P<0.05），在海马区仅与生理组神经元密度差异有显著性意义（P<0.05）。

　　3.2  大脑皮层神经组织超微结构变化①生理组组织结构较好，神经细胞结构清晰，细胞为锥体形或多边形，胞浆较宽，细胞器丰富，可见较多的线粒体、粗面内质网、高尔基体、核糖体等，核染色质疏松，核仁清楚及少量吞噬溶酶体。未见明显水肿等其他变化。轴索结构清楚，微丝微管丰富，排列整齐（见图15）。②模型组神经细胞有变性，变性细胞程度不一，少数神经细胞轻度变性，但普遍程度较重。线粒体数量增多、增大或空泡变性，线粒体脊模糊，核糖体脱落。轴索肿胀空泡化，微丝微管数量减少，排列散乱。部分髓鞘结构松解或脱失，出现较多的吞噬溶酶体（脂褐素）。部分小血管内皮细胞有变性，血管周隙扩大，星形细胞空泡变性或溶酶体增多，足突破坏较明显（见图16）。③艾灸1组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，少部分神经细胞有空泡变性，线粒体基质较致密。轴索空泡化，微丝数量减少，排列散乱。部分髓鞘结构松解或脱失，出现吞噬溶酶体。部分小血管内皮细胞有变性（见图17）。④艾灸2组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，轻度空泡变性，部分神经细胞基质及线粒体基质较致密，出现较多的溶酶体结构。核染色质轻度溶解。轴索轻度空泡化，微丝数量减少，排列较散乱，出现较多的溶酶体。部分小血管内皮细胞空泡变性，星形细胞尚可（见图18）。⑤电针组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，糖原较多，部分神经细胞糖原增多，轻度空泡化，或基质轻度致密，出现较多的溶酶体结构。核染色质轻度溶解。部分轴索空泡化，微丝数量减少，髓鞘结构松解或脱失，出现较多的溶酶体。部分小血管内皮细胞及星形细胞空泡变性（见图19）。⑥尼莫地平组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，细胞器及糖原较多，部分神经细胞空泡化，或基质轻度致密，出现较多的溶酶体结构，偶见神经细胞皱缩，呈暗细胞表现。部分轴索空泡化或微管聚集，髓鞘结构松解。部分小血管内皮细胞变性，星形细胞空泡变性，足突破坏（见图20）。⑦衰老组细胞凋亡，核膜凹陷，细胞核肿胀，胞浆空泡化，脂褐素增多，胞浆细胞器减少，线粒体结构不清，粗面内质网轻度扩张，有脱粒现象。部分轴索空泡化或微管聚集，髓鞘结构松解（见图21）。

    依病变程度从重到轻排序：衰老组，模型组，尼莫地平组，艾灸2组，电针组和艾灸1组，生理组。

　　4  讨论

    在动物和人类的研究中都观察到随着年龄的增加，大脑皮质、海马、基底节、小脑、脑干及丘脑和下丘脑等区都存在神经元数目减少的现象和趋势。神经元数目的减少是脑老化过程的重要事件［7］。无论在正常老化还是老年性痴呆,其病理改变主要见于海马和大脑皮质。其中海马又是最易受衰老影响的脑区之一。大量研究己证明海马与学习记忆特别是空间认知功能有关，尤其CA3区被认为与空间辨别性学习记忆活动的关系尤为密切［8］。由于海马与学习记忆关系密切以及海马对衰老的易感,许多学者将海马作为脑衰老研究的理想模型。脑组织是高耗能器官，线粒体既是细胞的供能站，也是氧自由基浓度最高的细胞器，D-半乳糖处理的动物，活性氧水平升高，脂质过氧化亢进［9］，体内超氧阴离子自由基反应，发生蛋白质交联，髓鞘变性等，使得线粒体的蛋白质、脂质、DNA损伤，随着时间的积累，这些损伤使氧化产物进一步增多，清除机制有限，导致脑老化。有学者［10，11］证实D-半乳糖处理小鼠海马神经元细胞凋亡，皮层神经元转录水平降低，RNA，蛋白质含量下降，神经细胞数目减少，提示D－半乳糖衰老小鼠模型出现神经元结构和脑功能减退，发生老化倾向，老龄动物的结果吻合。

    本实验也证实D－半乳糖衰老小鼠模型出现大脑皮质和海马CA3区锥体细胞的神经元细胞密度下降，核固缩、变性。与18月龄的自然衰老小鼠大脑皮质和海马CA3区神经元密度变化相似。本研究进一步观察了D-半乳糖处理动物的超微结构，模型组神经元细胞变性，核膜不规整，细胞早期凋亡。胞浆中，线粒体肿胀、空泡变性，线粒体脊模糊，粗面内质网排列紊乱,核糖体脱落。出现较多的吞噬溶酶体（脂褐素）。微丝微管数量减少，排列散乱，髓鞘结构松解或脱失，与18月龄衰老小鼠相似。有学者也在衰老的人脑组织中观察到相似的情况［12］，认为自由基损伤是细胞衰老的主要原因，细胞内脂褐素的沉积正是细胞膜系统发生过氧化反应的产物。脂褐素在细胞内积聚到一定程度,会造成核糖核酸的损害,最终将影响细胞的代谢，导致细胞死亡。老年脑中还可见到神经纤维缠结,其形成与痴呆程度相关,而构成神经纤维缠结的螺旋状缠绕纤维可能由神经微丝微管演变而来,是一种变异了的微丝蛋白,这种异常的细胞骨架成分可能会导致神经元的死亡。模型组微丝微管排列散乱，是否会进一步形成老年脑中病理特征的神经纤维缠结有待深入研究。本研究中生理组神经细胞结构清晰，细胞器丰富，结构完整，见少量吞噬溶酶体，微丝微管丰富，排列整齐。各治疗组神经元细胞有不同程度的变性损伤，但较模型组与衰老组轻。通过艾炷灸、电针、尼莫地平灌胃的干预治疗可以提高D-半乳糖衰老小鼠模型大脑皮质和海马CA3区神经元细胞的密度，减少神经元细胞的变性、凋亡，减轻D-半乳糖造成的氧化损伤，保护D-半乳糖衰老小鼠神经元细胞的超微结构，延缓脑老化。

    本研究结果表明艾炷灸、电针足三里、悬钟穴和艾炷灸百会、关元穴这两组处方都通过脾肾双补，补益髓海。足三里为阳土经土穴，土生万物，以后天补养先天之精；“胆主骨所生病”，悬钟为胆经穴位，八会穴之髓会，故悬钟可治髓所生病,且精血相生，乙癸（肝肾）同源，而肝胆两脏互为表里，胆属阳，阴阳相长，足三里、悬钟二穴配合属远道循经取穴，激发经气，气至病所，故可助精填髓。百会属督脉，为髓海之气转输之处，有近治作用；关元为元阴元阳关藏之处，足三阴与任脉之交会，能补肝、脾、肾三脏，有远道调整作用，二穴配合能使局部和整体功效相结合，补脾肾充髓海，使衰老的髓海得以补养。“以火补者，毋吹其火”艾炷灸因其操作待其自灭，更换艾炷，故以补为主，对防治老年病有一定的优势。研究结果艾炷灸与电针疗法比较差异无显著性意义，但艾炷灸疗法操作较为方便、无疼痛，更易为患者接受。

【参考文献】
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　　［11］王 珊，李 宁，于力方，等.D-半乳糖脑老化模型小鼠海马神经细胞凋亡的研究［J］.标记免疫分析与临床，2004，11(1):47.

　　［12］赵继宗，孙异临，任泽光，等.衰老脑组织的电镜对比观察［J］.中华神经外科杂志，1998，14(2):101.