银杏叶提取物对大鼠肝硬化的治疗作用及其机制研究
来源：岁月联盟
时间：2017-02-28
【关键词】 银杏叶提取物 肝硬化 肝细胞 细胞凋亡
银杏树叶的提取物（extract of ginkgo biloba，EGb）具有扩张血管，调节血脂，抑制血栓形成；改善记忆；清除自由基等多种药理作用。临床用于治疗心脑血管方面的疾病和癌症。已发现银杏叶提取物对肝纤维化、肝癌等具有一定的治疗作用〔１-6〕，临床上已有银杏叶提取物成功用于治疗失代偿期肝硬化的例子，本文主要研究银杏叶提取物——银杏叶片（每片含总黄酮醇苷9.6mg，萜类内脂2.4mg）对大鼠肝硬化的作用，并进行初步的机制探讨。
1 材料与方法
1.1 试验材料：
实验动物：60只SD大鼠，体重180-220g，购自河南省实验动物中心。动物合格证号：SCXK（豫）2005-0001，动物房温度为25±2℃，标准大鼠颗粒饲料饲养，自由饮水。
银杏叶片，扬子江药业集团生产，批号08011301。使用时用0.5%的CMC-Na混悬，配成不同浓度。
1. 2 主要试剂及仪器 ：
四氯化碳（CCl4）：郑州化学试剂二厂；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：上海浦东化学品有限公司，批号：20071026；透明质酸（HA）、层粘蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）放免试剂盒均购自北京北方免疫试剂研究所；其它试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。BT2000全自动生化分析仪，意大利Vialicenza，Roneoo156。TUNEL 试剂盒, 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 模型制备 ：
60只大鼠适应性饲养1周，随机分为造模组50只和正常组10只。采用复合造模方法复制大鼠肝硬化模型〔７〕，每周2次皮下注射四氯化碳，0.3ml/100g体重，共10周。造模开始第1-2周均以20%猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料喂养，第3-9周以0.5%胆固醇和99.5%玉米面混合饲料喂养。整个造模期间以30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。造模过程中死亡3只。实验10周末造模组随机抽取3只经肝组织病理切片确认造模成功后予以分组治疗。
将造模成功的44只大鼠随机分为4组，每组11只，即模型组、EGb 高、中、低剂量组，分别灌胃给予0.5%的CMC-Na及20m g/kg 、15mg/kg、10m g/kg的EGb。给药30天，给药过程中模型组死亡一只。给药结束后，大鼠禁食14小时，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血后处死动物，取肝脏。离心分离血清，全自动生化分析仪测定血清总蛋白（T-P）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）含量，计算白蛋白/球蛋白（A/G）比例；放免法测定血清中HA、LN、PCⅢ含量。肝细胞凋亡原位检测按照试剂盒说明书操作进行，凡满足下列条件之一者即确定为凋亡肝细胞：（1）出现凋亡小体；（2）核呈新月形；（3）核浓缩。每张切片选择5个具有代表性的高倍视野（400×），共计数500个肝细胞，取阳性细胞平均百分率作为凋亡指数（Apoptosis index，AI），即：凋亡指数=（5个高倍视野内阳性肝细胞数之和/500）×100%。
1.4 统计学处理：
所有数值以±S，利用SPSS11.0软件进行单因素方差分析、两两比较及相关性分析，p<0.05具有显著性差异，p<0.01具有极显著性差异。
2 结果
2.1 银杏叶片对肝硬化大鼠血清中ALT、AST、TBIL的影响：
肝硬化模型建立后，肝细胞受损，细胞中的酶释放进入血液中，导致血清中ALT、AST含量明显升高；同时，肝功能受损时，胆红素不能与葡萄糖醛酸结合进入胆汁而在血液中蓄积，引起血液中总胆红素水平升高。经EGb干预后，与模型组相比，银杏叶提取物高中低剂量组可明显降低血清中ALT、AST、TBIL的含量，并呈剂量依赖性。
2.2 银杏叶片对肝硬化大鼠血清中T-P、ALB、A/G的影响
肝硬化大鼠肝脏受损后，合成蛋白质的能力下降，从而导致T-P、ALB的量降低，同时肝细胞损伤时球蛋白生成增加，故A/G显著降低。经银杏叶提取物干预后，与模型组相比，银杏叶提取物各剂量组可显著升高T-P、ALB和A/G。
2.3 银杏叶提取物对肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ水平的影响
2.4 对凋亡指数的影响：
正常组肝组织中TUNEL染色阳性肝细胞较少见，多散在分布于中央静脉周围。模型组可见不同程度的TUNEL染色阳性肝细胞，发生凋亡的肝细胞常位于脂肪变严重以及炎症细胞浸润区域附近，随着脂肪肝程度以及肝细胞炎症、坏死的加重，其肝细胞凋亡指数明显增高。给予EGb后发现TUNEL染色阳性肝细胞减少，与模型组相比，EGb高、中剂量组肝细胞凋亡指数明显降低。
3 讨论
肝硬化是肝脏慢性反复损伤后肝脏细胞外基质（ECM）合成与降解之间平衡失调、细胞外基质过度沉积的结果。当肝细胞被破坏、细胞膜通透性增高及线粒体损伤时，AST和ALT被释放到血液中，使之明显升高，酶活性的高低与肝细胞受损的程度相一致；肝细胞受损时，胆红素不能与葡萄糖醛酸结合进入胆汁而在血液中蓄积，引起血液中总胆红素（TBIL）水平升高。此外，血清白蛋白主要是由肝细胞合成的，肝功能损害时，血清白蛋白水平下降，而由免疫器官产生的球蛋白量增加。慢性肝炎和肝硬化患者的白蛋白产生减少，同时球蛋白产生增加，造成A/G比值倒置。本实验结果显示，银杏叶提取物各剂量组可显著降低肝纤维化大鼠血清AST、ALT水平，提高T-P、ALB含量和A/G比例，表明银杏叶提取物具有保护肝细胞，改善肝功能的作用。
PCⅢ、HA、LN分别是胶原蛋白、蛋白多糖、粘连糖蛋白三种细胞外基质成份的代表。Gabrielli等〔８〕认为PCⅢ、HA、LN 三项指标在各型肝炎中随肝脏受损程度而变化，分别在急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化之间依次升高。其升高幅度与肝组织增生程度呈现良好的正相关。血清PCⅢ反映了肝内胶原代谢的变化〔９〕，肝脏间质细胞合成HA增加或肝窦内皮细胞摄取HA减少均可引起血清HA升高〔１０〕，血清LN值被认为是反应基底膜更新率的指标，可反映肝窦毛细血管化和汇管区肝脏受损的范围〔１１〕。本试验结果表明，EGb各剂量组可明显降低大鼠血清PCⅢ、HA及LN，提示EGb可减少肝细胞合成HA或增加肝窦内皮细胞摄取HA，降低基底膜的更新率，抑制肝硬化的发展。由此表明EGb具有保护肝细胞、抑制肝硬化发展的作用。
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