山茶种子对乏营养状态下胰腺癌细胞耐受性消除作用的研究

          作者：史丽颖, 唐玲, 吴小娟, 林红景, 冯宝民, 王永奇 

【摘要】  　　目的探讨山茶种子对乏营养状态下胰腺癌细胞耐受性的消除作用。方法使用山茶种子的不同提取物, 分别作用于有营养状态下的胰腺癌细胞和乏营养状态下的胰腺癌细胞。用cell counting kit-8 (CCK-8) 活细胞计数法检测样品对胰腺癌细胞存活率的影响。结果山茶种子醇提物醋酸乙酯层能优先在乏营养状态下有效消除胰腺癌细胞的耐受性, 在50 μg/ml的浓度下，胰腺癌细胞的存活率仅为1.4%。结论山茶种子醇提物醋酸乙酯层能优先在乏营养状态下杀死胰腺癌细胞, 提示其在胰腺癌治疗上可能有一定的应用前景。

【关键词】  山茶 胰腺癌 癌细胞耐受性

　　Abstract：ObjectiveTo explore the ability of the seed of Camellia semiserrata Chi to eliminate the tolerance of pancreatic cancer cells to nutrient starvation. MethodsThe extracts of the seed of C. semiserrata Chi were used to treat the pancreatic cancer cells under the nutrient-deprived condition and nutrient-rich condition. The effect of treatment with various samples on survival rate of pancreatic cancer cell was examined with cell counting kit-8 (CCK-8). ResultsEtOAc fraction of the EtOH extract from the seed of C. semiserrata Chi exhibited strong ability to eliminate the tolerance of the pancreatic cancer cell to nutrient starvation. The survival rate of pancreatic cancer cells was 1.4% at a concentration of 50 μg/ml. ConclusionEtOAc fraction of the EtOH extract from the seed of C. semiserrata Chi was found to kill PANC-1 cancer cells preferentially under nutrition starvation. It may be useful for pancreatic cancer therapy.

　　Key words：Camellia semiserrata Chi;  Pancreatic cancer;  Tolerance of cancer cells
   
　　胰腺癌 (Pancreatic cancer) 是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，近年来在世界范围内其发病率呈现出明显上升的趋势。由于发病隐袭和高度进展性，胰腺癌早期诊断十分困难，大多数患者在确诊时已达局部晚期或发生远处转移，治疗棘手，死亡率极高。因此必须积极应用化疗、放疗、生物治疗等综合手段，提高手术后长期生存率。近年来，胰腺癌的药物治疗已经有了显著的进步，尤其是化疗已经成为必不可少的治疗手段之一［1］。
   
　　临床上血管造影术显示人类的癌经常是少血供、缺氧状态的肿瘤组织与极度恶性的癌相关。对此一个可能性的解释就是癌在发展过程中缺氧状态迫使肿瘤去获得血管再生，同时肿瘤也获得了耐受乏营养状态的能力，这也是恶性肿瘤的另外一个关键特征。如预期的一样，PANC-1胰腺癌细胞系，一个少血供肿瘤的典型代表，已经被发现耐受葡萄糖缺乏。既然生理反应所调控血流供应给正常组织，因而慢性缺血不应该出现在正常组织，所以Esumi等人设想消弱肿瘤对乏营养状态的耐受性将是癌症治疗方案的一个新目标［2～4］。
   
　　山茶Camellia semiserrata Chi属于山茶属Camellia Linn. 植物，主产于我国西南部和东南部，在对广西药用资源调查研究的基础上，我们发现在以往的文献报道中山茶在抗癌方面有一定的活性［5］，进而我们对山茶的抗胰腺癌活性进行了研究。 基于Esumi等人的假设，我们检测了山茶种子提取物对胰腺癌细胞的乏营养状态耐受性的消除作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  生药材山茶种子采集于广西巴马地区，由辽宁师范大学陈辰教授鉴定。

　　1.2  细胞系和培养液人胰腺癌细胞系PANC-1从American Type Culture Collection获得，培养于含有10%小牛血清，2% L-谷氨酰胺，1% 青霉素和1%链霉素的DMEM (日本日水制药株式会社) 培养液中。乏营养培养基由265 mg/L CaCl2(2H2O), 0.1 mg/L Fe(NO3)2(9H2O), 400 mg/L KCl, 200 mg/L MgSO4(7H2O), 6 400 mg/L NaCl, 700 mg/L NaHCO3, 125 mg/L NaH2PO4, 15 mg/L 酚红，25 mmol/L HEPES 缓冲液和MEM维生素液，最终以10% NaHCO3调pH至7.4［6，7］。

　　1.3  在乏营养状态下的细胞毒作用将PANC-1 胰腺癌细胞种于96孔培养板，每个孔细胞数为1×104。培养于DMEM培养液中，在37℃，5% CO2条件下培养24 h。培养24 h后，以PBS冲洗细胞，加入新的DMEM培养液或乏营养条件的培养液，然后立即加入系列浓度的待测样品。培养24 h后，再次用PBS冲洗细胞，然后加入含有10% 活细胞计数试剂CCK-8的DMEM培养液100 μl，继续培养2 h，然后在450 nm波长下测定每个孔的吸光度值［6，7］。因为吸光度值与培养液中活细胞数成正比，所以通过吸光度值可以计算细胞存活百分率。

　　2  结果
   
　　用浓度分别为50 μg/ml和100 μg/ml的山茶种子的不同提取物处理PANC-1人胰腺癌细胞，每个样品分别作用于有营养状态和乏营养状态下的PANC-1胰腺癌细胞。结果发现山茶种子醇提物能消除PANC-1胰腺癌细胞对乏营养状态的耐受性。经山茶种子醇提物在浓度分别为50 μg/ml和100 μg/ml处理后，在乏营养状态下PANC-1胰腺癌细胞的存活率分别为20.6%和0%，而在有营养状态下细胞仍然全部存活 (表1)。此外，山茶种子醇提物醋酸乙酯层和醇提物过D101大孔树脂40% EtOH-H2O洗脱部分也能有效消除PANC-1胰腺癌细胞对乏营养状态的耐受性。山茶种子醇提物醋酸乙酯层，在50 μg/ml浓度下处理细胞，在乏营养状态下细胞的存活率仅为1.4%，在有营养状态下细胞几乎全部存活，但在100 μg/ml浓度下处理细胞，在乏营养状态下细胞的存活率为0%，在有营养状态下细胞却也有部分死亡，存活率为76.9%。山茶种子醇提物过D101大孔树脂40% EtOH-H2O洗脱部分在50 μg/ml和100 μg/ml浓度下处理细胞，在乏营养状态下细胞的存活率为9.6%和0%，在有营养状态下细胞几乎全部存活 (表1)。表1  山茶种子不同提取物对乏营养状态下胰腺癌细胞耐受性的消除作用（略）