庆大霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究
来源：岁月联盟
时间：2017-02-28
【关键词】 庆大霉素 制备 检测
庆大霉素是由小单胞菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，对多种革兰阳性和阴性菌都具有显著的抗菌效果，作为饲料添加剂和治疗疾病的抗生素广泛应用于畜牧业。然而，庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重。庆大霉素残留的ELISA检测国外已有报道，但是利用ELISA法研究其在牛奶中的残留规律，国内外尚未见报道。
本文合成了庆大霉素的免疫原和包被原，制备了单克隆抗体，采用MALDI—TOF MS对蛋白偶联抗原进行了表征，建立了检测庆大霉素的酶联免疫检测法，并成功地用于牛奶中庆大霉素的实际检测。
1 材料与方法
1．1 试剂：庆大霉素硫酸盐、血蓝蛋白丁二酸酯(sKLH)、牛血清白蛋白(BSA)、碳化二亚胺盐酸盐(EDC?HCI)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记羊抗鼠IgG：SIGMA；PEG 1500：Gibco。
1．2 实验动物BALB／C小鼠，购于济南生物制品所。
1．3 庆大霉素全抗原的合成鉴定
1.3．1 免疫原的合成：取40mg庆大霉素硫酸盐和12mgsKLH溶于1．5 mL PBS，在磁力搅拌器中进行均匀地搅拌。取280mgEDC?HCl溶于lmL PBS中，调pH至7．5，再慢慢地滴加到上述混合溶液中，并且在室温下搅拌1 h左右，然后于5℃放置2d。用PBS透析3d后，分装，—20℃贮存。
1．3．2 完全抗原的鉴定：利用MALDI—TOF MS测定BSA及genta—BSA分子量，并根据分子量计算偶联比率。
1．4 单克隆抗体制备
1．4．1 免疫方法：首免采用CAP—BSA与等量福氏完全佐剂注射器互推法乳化完全后腹腔注射，剂量为100μg／只。
2周后，换用福氏不完全佐剂二免，以后每隔14天强免1次。三免后8d，小鼠断尾采血，用间接ELISA方法检测血清效价，直至血清效价达到1：8000以上。融合前2d，不加佐剂尾静脉注射强免1次，按常规方法融合免疫脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞。
1．4．2 细胞融合取小鼠脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞在PEGl500作用下融合。将融合后的细胞悬液加入含饲养细胞的96孔细胞培养板中，以HAT培养基选择培养。
1．4．2 细胞融合取小鼠脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞在PEGl500作用下融合。将融合后的细胞悬液加入含饲养细胞的96孔细胞培养板中，以HAT培养基选择培养。
