庆大霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

        1．4．3 阳性杂交瘤细胞筛选及克隆化：融合细胞于第10天用HT培养液半量换液；用间接ELlSA和阻断ELISA进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，而后扩大培养、冻存、鉴定和建株。
        1．4．4 单克隆抗体制备：用高压灭菌(115℃)的石蜡油注入到雌性BALB／c小鼠(5—7周龄)腹腔内，0.5ml／只。8—11d后，每只小鼠腹腔注射2×105个杂交瘤细胞，当小鼠腹部胀大时收集腹水，间接ELISA方法测定效价并及时冻存。再7 d后取小鼠腹水，用ProteinG柱纯化，获得抗庆大霉素单克隆抗体IgG。
        1．5 抗体特效的测定用于抗体交叉反应性研究的竞争物为卡那霉素、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢氨苄、磺胺二甲氧嘧啶、恩诺沙星。利用Marker中标准蛋白在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量的关系做标准曲线，SPSS进行曲线拟合并求回归方程。将4B12的重链和轻链在凝胶中的相对迁移率代人回归方程，再根据IgG中重链和轻链的比例关，系计算其相对分子质量。
        1．6 牛奶检测应用：取5头患乳房炎奶牛，1．8mg／kg体重肌肉注射庆大霉素注射液进行治疗，早晚各注射1次，连续给药3d。停药后分别于第7、14、24、35、50、62、75、85、100h采集牛奶样品，5头牛共50份样本，4℃，2000r／min离心10min，去除上层脂肪，用PBS缓冲液将样品做10倍稀释，取50uL用竞争性ELISA法进行检测。
        2 结果
        3 讨论
        庆大霉素是小分子物质，不具备免疫原性，因此需要载体蛋白与其偶联才可形成完全抗原。本研究采用碳二亚胺法将庆大霉素的氨基与载体蛋白的羧基交联制备免疫抗原和包被抗原。碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使庆大霉素上的羧基与载体蛋白上酌氨基形成酰胺键，但这种缩合反应没有选择性，易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物，严重影响了偶联的效率，为了减少蛋白的自身反应，本试验采用封闭羧基的血蓝蛋白丁二酸酯作为载体蛋白，能有效减少蛋白之间聚合。单克隆抗体的制备多采用动物体内诱生法。在接种杂交瘤细胞的前10 d，给小鼠注射灭菌液体石蜡、降植烷或者弗氏不完全佐剂，其原理是液体石蜡等腹水刺激剂能有效抑制小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的免疫功能，使小鼠能更好的接纳腹腔中具有恶性生长特性的杂交瘤。在这种环境中，杂交瘤将逐步增殖，并分泌抗体于腹水中。本试验采用高压液体石蜡预处理小鼠，15d后注射杂交瘤，16 d后收集腹水，获得较好的效果。

参考文献
［１］ 范国英．王顺岗．王自良.链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制及应用2008(3)