电离辐射对人乳腺癌细胞FGFR2基因表达的影响

                          作者：孙克康 徐加英 焦旸 杨倞 胡旭东 赵超前 樊赛

【摘要】  目的  了解电离辐射对人类乳腺癌MDA-MB-231细胞FGFR2基因表达的影响。方法  将MDA-MB-231细胞培养至密度为60%左右，采用0；2；4；6；8和10Gy六个不同剂量的X射线照射，24小时后收集样品。采用RT-PCR法测定FGFR2基因在照射后mRNA表示水平的改变。结果  2和4Gy的X射线照射，FGFR2基因的表达较对照组明显降低，随后随剂量的增加表达量又逐渐上升。结论  电离辐射在低剂量组2和4Gy使乳腺癌细胞FGFR2基因表达降低，随后又逐渐上升。
【关键词】  乳腺癌  电离辐射  成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）
        乳腺癌是女性健康的一大杀手，全球每年有约50万妇女死于这种癌症。在我国，其人群发病率为23/10万，占全身各种恶性肿瘤的7-10%，每年死于乳腺癌的患者约四万余人[1]。2007年5月，来自英国剑桥大学的一份研究论文[2]描述对4400位患有乳腺癌女性和4300位健康女性的基因组进行的对比分析结果，发现单DNA碱基对上的30个不同之处。通过进一步研究，研究人员确定出了4个与乳腺癌显著相关的基因， 即FGFR2、TNRC9、MAP3K1和LSP1。在这4个新发现的基因中，与乳腺癌最有显著相关性的是FGFR2基因。大约有16%的女性拥有FGFR2基因的两个高风险副本，这使她们患乳腺癌的风险比其女性高出了60%。放射治疗是应用电离辐射作用于肿瘤细胞，导致癌细胞死亡。目前在临床上约70％的癌症病人在癌症治疗的过程中采用放射治疗，约有40％的癌症则可以用放疗有效的控制，如鼻咽癌、食管癌、淋巴瘤等。大量研究表明FGFR2基因与多种肿瘤如膀胱癌，胰腺癌，胃癌，结肠癌的发生和发展有密切的关系，但该基因与乳腺癌的关系未见报道。本实验首次将放疗与新确定的乳腺癌相关基因FGFR2联系起来，了解放射治疗对FGFR2基因表达产生的影响。本研究在乳腺癌治疗基础研究上有着非常重要的意义，对今后乳腺癌的临床治疗具有重要的指导意义。
        1 材料与方法
        1.1材料  人类乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自于美国ATCC菌种保藏中心。DMEM培养基干粉和新生小牛血清（Gibco公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），CKX41倒置显微镜、PCR仪和凝胶成像仪（Bio-Rad公司），其余实验所需有机或无机试剂均由Sigma公司购得。
        1.2方法
        1.2.1细胞培养
        人类乳腺癌MDA-MB-231细胞培养在含10%小牛血清、青霉素100 U/ml、庆大霉素100 U/ml的DMEM培养基中。细胞培养在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下。取对数生长期MDA-MB-231细胞，以5×105密度将细胞接种至50ml的培养瓶中，等细胞生长至60%左右，采用0；2；4；6；8和10Gy六个不同剂量的X射线照射处理，照射24小时后收集样品。
        1.2.2RT-PCR收集细胞，按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA，紫外分光光度计分别测定RNA浓度和纯度（A260/A280>1.90）。各取总RNA5μl，加入1μlOligo(dT)，10μlDEPC水，70℃水浴5分钟，冰浴冷却30秒。然后在冰上加入4μl 5x反应液， 1μl RNase抑制剂(20U/μl)，2μl dNTP混合液(10mmol/L)，在37℃水浴加热5分钟。加入1μl M-MuLV反转录酶(20 μg/μl)，在37℃逆转录1小时，最后在70℃灭活逆转录酶10分钟，-20oC冰箱保存备用。根据FGFR-2基因序列，采用primer premier 5软件进行引物的设计。引物序列分别为上游引物5’-CCCATCTGACAAGGGAAAT-3’，下游引物为5’-TCTGGCGAGTCCAAAGTC-3’，扩增产物为500 bp。GADPH上游引物为5′-CAACTACATGGTCTACATGTTCC-3′，下游引物为5’-CAA CCTGGTCAGTGTAG-3’，扩增产物为700bp。反应条件为：48℃逆转录45分钟；94℃灭活及预变性2分钟；再经58℃ 45秒， 72℃ 45秒， 反应35个循环，68℃延伸7分钟。最后，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，40V条件下1小时，在凝胶成像仪（Bio-Rad）上观察并拍照。
        2 结果
        X射线照射24 h后，人类乳腺癌MDA-MB-231细胞FGFR2基因表达剂量依赖关系。如图所示：给予2、4、6、8、10GyX射线照射后，FGFR2的基因表达与对照组相比在低剂量组（2和4Gy）明显降低，此后又略有上升，但总体上表现为降低。说明X射线照射可抑制FGFR2基因的表达，在低剂量时更为明显。  
 
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图1. MDA-MB-231细胞的FGFR2 基因RT-PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳
（0为对照组，2，4，6，8，l0Gy分别为不同的照射剂量。收集呈对数生长的细胞并按“材料和方法”中所描述的RT-PCR法测定FGFR2 mRNA的表达水平。本实验重复三次。GADPH mRNA同时测定作为样本间的对照）