E-钙粘素在结直肠癌中的表达及其与淋巴结微转移的关系
作者:张翼飞 姜立新 郑海涛
【摘要】 目的 检测结直肠癌组织中E-钙粘素的表达及其淋巴结微转移,探讨两者间的关系。方法 以CK20 mRNA为标记物,应用RT-PCR对60例结直肠癌根治性手术切除的淋巴结标本共782例进行检测;免疫组化法(SP法)检测结直肠癌组织、癌旁组织、淋巴结微转移及正常对照组中E-钙粘素的表达。通过二者的综合分析,试图发现抑癌基因E-钙粘素在结直肠癌淋巴结微转移的生物学行为中的作用。结果 CK20法检出45例(75.0%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为436个(55.8%);常规病理学检出34例(56.7%)患者有淋巴结转移,检出阳性淋巴结数为356个(45.5%);两组比较,差异具有统计学意义(χ2=16.72,P<0.05)。11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)E-Cadherin表达阴性,而15例未检出淋巴结微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性,两者比较差异有统计学意义(χ2=4.160,P=0.041)。结论 E-Cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。
【关键词】结直肠癌;E-钙粘素;淋巴结转移;逆转录聚合酶链反应
【Abstract】 Objective Purpose To detect the expression of E-cadherin in colorectal carcinoma and lymph node micrometastases,and investigate their relationship.Methods 82 cases of lymph node simple was dectected with RT-PCR method using CK20 mRNA acridinium ester.in screening colorectal carcinoma lymph node micrometastases. E-Cadherin expression analysed byimmuno-histochemical staining (the SP method) in colorectal cancer tissue, tissue nearby cancer, the normal control tissue. Results In 60 cases of colorectal carcinoma,the expression of E-Cadherin was 71.67%.Number of positive nodes was 55.8%, the expression of E-cadherin was 56.7%(34 cases) and number of positive nodes was 45.5%(356 cases) through routine pathological examination. The low level expression of E-Cadherin was positively correlated with the Dukes staging, serosa infiltration, lymph node and liver metastasis of colorectal carcinoma(χ2=16.72,P<0.05).The expression of E-Cadherin was negative in 6 of the 11 patients with lymph node micrometastases,and in 6.67%1 of the 15 patients without lymph node micrometastases(χ2=4.160,P=0.041).Conclusion The negative expression of E-Cadherin may contribute to lymph node micrometastases in colorectal carcinoma.
【Key words】
colorectal carcinoma; E-Cadherin; Lymphatic metastasis; Rt-pcr
结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。每年有10%的恶性肿瘤患者死于结直肠癌[1,2]。术后复发和转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。在实施了根治性手术的结直肠癌患者中,仍有20%~50%的患者死于术后肿瘤的局部复发和转移[3,4],有研究认为该现象与结直肠癌淋巴结微转移有关。E-Cadherin粘附分子介导细胞粘附的紊乱涉及肿瘤的发展和转移。E-Cadherin表达或功能的丧失与癌细胞丧失分化和较高的侵袭能力有关。本研究通过免疫组化方法检测E-Cadherin粘附分子在结直肠癌和转移灶的表达,以CK20为靶目标,应用RT-PCR法检测结直肠癌淋巴结的微小转移,以探讨结直肠癌浸润转移相关基因的表达与临床分期、浸润转移的关系。探讨结直肠癌组织中E-Cadherin的表达及其与淋巴结微转移的关系,试图对结直肠癌转移做出预测和早期诊断,为临床治疗提供依据和手段。
1 实验材料及方法
1.1 实验材料
1.1.1 病例与标本 收集我院2005~2007年散发性结直肠癌根治术后标本60例,其中男32例,女28例;年龄28~79,平均58.4岁。所有患者术前均未行放、化疗;剔除遗传性非息肉病性散发性结直肠癌和家族性腺瘤性息肉病。分化程度:高分化23例,中分化21例,低分化16例;淋巴结转移34例,无淋巴结转移26例;TNM分期I期6例,II期26例,III期22例,IV期6例。术中采集散发性结直肠癌患者肿瘤周围肿大淋巴结共782个,剖开,一半行常规术后病理,另一半保存于-80℃冰箱备用。选择远癌“正常”大肠黏膜组织(距癌灶>4 cm)和癌旁(距癌灶<2 cm)大肠黏膜组织各10例作为对照观察。所有标本经10%福尔马林液固定,常规石蜡包埋。本研究得到医院伦理委员会批准,所有患者本人均签署知情同意书。
1.1.2 试剂 鼠抗人E-Cadherin单克隆抗体和S-P试剂盒(Zymed公司)。TRIzolReagent(Invitrogen公司),TAKARA AMV逆转录试剂盒(Takara公司),TAKARA LA Taq(Takara公司),PCR试剂(Takara公司),DNA分子量Marker(晶美公司)。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的抽提 采用标准TRIzol法(参照说明书)提取术后淋巴结标本的总RNA,凝胶电泳和分光光度计检测RNA浓度和纯度。
1.2.2 cDNA制备 总RNA样品1 μl,依次加入Oligo dT(18)0.5 μl,MgCl2 2 μl,10×RT Buffer 1 μl,RNase Free dH2O 3.75 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,RNase Inhibitor 0.25 μl,AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl。总反应混合物于30℃反应10 min,42℃反应30 min,99℃反应5 min,5℃反应5 min。
1.2.3 引物的合成 在NCBI数据库中查找编码人类基因CK20的核酸序列,其登录号为NM_019010,该序列长1817 bp,编码序列CDS(Coding Sequence)位于43-1317 bp间。以此序列为基础,在CDS区内设计引物。上游引物5’-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC-3’下游引物5’-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT-3’扩增片段为449 bp大小,引物由上海英俊公司合成。
1.2.4 PCR反应和分析 采用RT-PCR方法,以人结直肠癌淋巴结cDNA为模版.反应体系为50 μl:cDNA模版1 μl,10× LA PCR缓冲液5 μl,25 mmol/L MgCl2 5 μl,20 pmol/μl 上游和下游引物各1 μl,10 mmol/L dNTP Mixture 2 μl,LATag酶0.5 μl,补去离子水至50 μl。PCR反应条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,58.5℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃再延伸5 min。反应完毕后进行电泳分析。
1.2.5 结直肠癌组织切片厚4 μm,0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复,S-P免疫组化染色。染色步骤按说明书进行,DAB显色,苏木精复染胞核。PBS代替第1抗体作阴性对照。
1.3 统计学方法 资料的统计分析在SPSS13.0软件包中进行,数值变量以均数(95%可信区间)表示,计数资料用率来表示,两组间率的比较采用χ2检验法。并采用诊断性实验分析方法计算CK20与传统病理切片技术诊断结直肠癌淋巴结转移的准确度、敏感度和特异度。
实验结果:
图A E-Cadherin在正常大肠黏膜上皮细胞中的表达 40×
图B E-Cadherin在结直肠癌组织中的表达 40×
2 结果
2.1 60例散发性结直肠癌患者的782个受检淋巴结经常规病理学检查,34例(56.7%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为356个(45.5%)。而采用RT-PCR法检测CK20 mRNA的表达情况来判断淋巴结转移,结果显示,45例(75.0%)患者有淋巴结转移,较病理学检查结果新增11例,差异具有统计学意义(χ2=4.483,P=0.034)。阳性淋巴结总数为436个(55.8%),较病理学检查结果新增80个,差异具有统计学意义(χ2=16.371,P<0.001)。
2.2 E-Cadherin表达与结直肠癌临床病理参数的关系 E-Cadherin在癌组织中的表达阳性率显著低于癌旁组织(P<0.05)。E-Cadherin低表达与结直肠癌Dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移呈正相关(P<0.05)。
2.3 11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例E-Cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例表达阴性,两者差异有统计学意义(χ2=4.160,P=0.041)。
