超声波法提取大黄胰蛋白酶抑制剂

                     作者：杜旭东，刘同祥，张宗申，牛建昭，王继峰

【摘要】  　　目的　研究大黄中胰蛋白酶抑制剂活性成分的最佳提取条件。方法 以提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标，采用正交实验法对提取溶剂用量 (A)、提取温度(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4个因素进行优选研究，并以优选出的提取方案进行验证实验。结果因素B，D对提取效果有显著的影响，因素C影响不显著。结论 大黄中胰蛋白酶抑制活性成分有效部位的最佳提取工艺为A3B1C3D2。

【关键词】  大黄； 超声提取； 胰蛋白酶抑制剂； 正交实验

　　Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction procedure for trypsin inhibitor from Rheum officinale Baill．MethodsThe inhibition rate of trypsin activity was used as screening parameter, we employed the orthogonal design method to test the effects of four factors, including volume of extraction solution (A), temperature of extraction solution (B), time of extraction (C) and extracting times(D), on the extraction of trypsin inhibitor, then after to examine the optimized procedure. ResultsFactor B and D performed significant effect on the extraction, and Factor C came next. ConclusionThe optimum extraction technology was A3B1C3D2 when the inhibition ratio of trypsin activity was considered as preferential parameter.

　　Key wordsRheum officinale Baill；  Ultrasonic wave extraction；  Trypsin inhibitor；  Orthogonal design

    蛋白酶抑制剂（Proteinase inhibitor, PI）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质，广泛存在于动、植物和微生物中。PI在体内能与相应蛋白酶的活性中心结合，从而抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶，使体内蛋白酶抑制剂与蛋白水解酶形成一个动态平衡，在一系列的生理代谢过程中起着调控作用，是生物体内免疫系统的重要组成部分［1］。其中胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor, TI）具有重要的药用价值,对急性胰腺炎、肺气肿、休克、脑水肿和脑缺血等都有很好的临床效果，还有研究表明其对 HIV 和肿瘤的治疗也有重要意义［2］。在临床应用中，化学合成的蛋白酶抑制剂有着生物利用度低的缺点，以及不可避免地产生副作用和耐药性，且化学合成的PI生产成本高，价格昂贵。天然植物来源的蛋白酶抑制剂具有环境兼容性好、安全、开发成本低等优点，符合药物的趋势［3］。因此，从传统中药中筛选具有TI活性成分的药有很广阔的应用前景和市场价值。
   
　　刘同祥等［4］的筛选试验结果表明中药大黄有很好的胰蛋白酶抑制活性。随着大黄药理和临床应用研究的深人 ，发现它具有抗肿瘤 、保肝利胆 、改善肾功能 、活血止血 、降血脂等多方面的作用。本实验以大黄Rheum officinale Baill为材料，对胰蛋白酶抑制剂的提取条件进行了研究。

　　1  器材

　　1.1  仪器

　　可见光分光光度计(7202B型 上海尤尼柯仪器有限公司) 、离心机（LD-4型 北京医用离心机厂）、精密pH 计（PHS-3型 上海雷磁仪器厂）、数显恒温水浴锅（HH-6型 江苏金坛荣华仪器制造有限公司）、精密天平（FA2004N型 上海民桥）、超声波清洗器（KQ-500B型 昆山市超声仪器有限公司）。

　　1.2  试剂胰蛋白酶( 北京麒麟宏伟公司) 、大豆蛋白酶抑制剂（国药集团化学试剂有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（上海三杰生物技术有限公司）、三-羟甲基-氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等为国产分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  大黄胰蛋白酶抑制剂的抑制率测定采用苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）法［5］：取胰蛋白酶液1 ml，加药材提取液1 ml在37℃水浴保温5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保温10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）终止反应，用分光光度法在410 nm波长条件下测定吸光度。按下列公式样品提取液的抑制百分率：i=(Ar-Abr)- (As-Abs)(Ar-Abr)×100% 式中：

    i —抑制百分率，%

    Ar —标准溶液的吸光度

    Abr—含标准溶液的空白对照液的吸光度

    As—样品溶液的吸光度

    Abs—含样品溶液的空白对照液的吸光度

　　2.2 粗提溶剂的选择取磨碎生药5 g，在60℃下，分别用双蒸水及10%，30%，50%，70%，90%的乙醇作为提取溶剂进行实验，超声提取2 h。结果如图1所示，随着乙醇浓度的增大，提取液对胰蛋白酶活性的抑制率下降，双蒸水效果最好。

　　2.3  各因素的最佳范围确定

　　2.3.1  最适温度的确定根据上述结果，取磨碎的大黄5g，加双蒸水150 ml，分别在10，30，50，70，90℃条件下超声提取2 h，过滤、离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率，结果表明在40～50℃范围内提取液对胰蛋白酶活性的抑制率最高。见图2。

　　2.3.2  最适体积的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，分别按1∶10，1∶20，1∶30，1∶40（W/V）超声提取2h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着体积比的增大提取液对胰蛋白酶活性的抑制率在上升。见图3。

　　2.3.3  最适提取时间的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，按1∶30体积比，分别超声提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着时间的增加提取液对胰蛋白酶活性的抑制率增大，当达到1.5 h后增加的幅度开始下降。见图4。

　　2.3.4  最适pH值的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，按1∶30体积比，在pH为3，5，7，9，11的条件下超声提取2 h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果如图5所示，各个条件下变化幅度不大，在中性条件下提取液抑制效果最好。

　　2.3.5  最适提取次数的确定取磨碎的大黄5 g，在60℃下，按1∶30体积比，每次提取2 h，分别提取1次，2次，3次，4次后合并滤液，离心后减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着提取次数的增多，提取液对胰蛋白酶活性的抑制率上升。见图6。
　　
　　2.4  各因素影响下的最优提取工艺的确定

　　2.4.1  大黄胰蛋白酶抑制剂提取的正交实验设计根据溶剂选择实验结果，本实验采用双蒸水作为提取TI的溶剂。称取磨碎大黄5 g，在平行操作条件下，选用L9(34)正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行9次实验，每次实验重复3次（正交因素水平见表1）。表1  因素水平（略）表2  L9(34)正交实验结果（略）表3 正交实验的方差分析（略）

　　2.4.2  结果与方差分析

　　由R值可知, 各因素对试验结果的影响次序为B>D>C>A。由K值可以得出当提取条件为A3B1C3D2时效果最好，即在30倍量水，45℃，1.5 h/次，提取2次为最佳提取工艺。此工艺条件刚好为7号试验，所以不用再做验证实验，其抑制率为79.4%，是所有实验中抑制率最高的。由方差分析可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B>D>C>A，其中因素B与D为高度显著，因素C对实验结果的影响较小,因素A没有统计学意义。

　　3  讨论

    由单因素实验结果可知，在提取温度较低时，随着温度的升高提取液对胰蛋白酶抑制率呈上升趋势，但是当温度达到50℃时抑制率开始下降，说明最佳的提取温度范围为40～50℃，但到70℃时仍保持很高的抑制率，说明TI耐高温性比较强；随着溶剂量的增大提取液对胰蛋白酶抑制活性升高，但随着提取溶剂量的增大会带来浓缩困难，从实验条件和生产成本考虑选用30倍体积（W/V）较合适；提取液的pH值对提取液的抑制率影响不大，但中性条件下提取效果较好一些，说明大黄TI易溶于中性溶剂中；提取液的抑制率随着提取时间呈正比，1.5 h后增加的幅度开始下降，综合考虑选用1.5～2.0 h比较合适；提取次数越多提取的效果越好，但经过两次提取后抑制率的增加就不明显了，结合实际生产和效率提取2次是最合适的。
   
　　本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化, 并按最佳工艺进行了验证实验, 结果证明用该工艺作为大黄TI的有效部位的粗提取，具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。但对大黄胰蛋白酶抑制剂的理化性质需要进一步研究。

【】
  　　［1］Pandya MJ ,Smith DA ,Yarwood A ,et al .Complete amino acid sequences of two inhibitors from buckwheat seed［J］. Phytochemistry ,1997 ,43：327.

　　［2］文方德，傅家瑞.植物种子的蛋白酶抑制剂及其生理功能［J］．植物生通讯，1997，33（1）：1.

　　［3］蔡步林，李卓荣.人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂的研究开发与展望［J］.生化药物杂志，2005，26（3）：179.

　　［4］刘同祥，牛建昭，杜旭东，等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛选［J］.中国中药杂志，2007，32（7）：643.

　　［5］Godbole SA , Krishna TG, Bhatia CR.Purification and characterization of protease inhibitors from piheon pea ( Cajanus cajan(L.) Millsp) seeds［J］.J Sci Food Agric，1994，64：87.