中性蛋白复合酶法提取大枣多糖的研究
【摘要】 目的考察中性蛋白复合酶法提取大枣多糖的工艺，并验证大枣多糖的部分药理作用。方法对不同提取方法作对比；以多糖的得率和纯度为指标，对效果较佳的中性蛋白复合酶提法安排正交实验，筛选提取工艺；最后进行动物实验。结果确定中性蛋白复合酶法提取的最佳工艺为：酶液浓度0.15%，pH 7.5，提取温度37℃；大枣多糖的药理实验表明大枣多糖属无毒级，大枣多糖大、中、小剂量对S180小鼠巨噬细胞吞噬率均有不同程度的提高作用。结论中性蛋白复合酶法提取大枣多糖工艺有效可行。
【关键词】 大枣多糖； 中性蛋白复合酶 ； 提取； 药理实验
Abstract：ObjectiveTo study the extraction technology for polysaccharide by compound neutral protease from Ziziphus jujuba, and to test the pharmacological function of the polysaccharide .MethodsDifferent methods of polysaccharide extraction were compared .As for the best method ,the compound neutral protease extraction , the orthogonal experiments were established to hunt its technology. Finally, the pharmacological experiments were carried out. ResultsThe optimum conditions were to add 0.15% neutral protease on the pH of 7.5 with 37℃. The ultimate pharmacologic experiments about Zizyphus jujuba polysaccharide showed that it had no toxicity and it could elevate the macrophage phagocytosis of S180 tumor mice.ConclusionThe way of the compound neutral protease extraction is effective and reasonable .
Key words：Jujuba polysaccharide; Compound neutral protease ; Extraction; Pharmacology experiment
大枣为鼠李科植物枣Zizyphus jujuba Mill 的成熟果实［1］，营养丰富，是传统的中药，其主要成分有多糖，蛋白质，氨基酸，维生素，生物碱，皂苷及矿物质等［2］。多糖能提高机体的免疫功能，是理想的免疫增强剂，同时对正常细胞没有毒副作用［3］。从大枣中提取多糖及其药理作用研究已有报道［4，5］。
传统高温水提法易造成大枣多糖的生物活性降低，而且能耗大；溶剂萃取法则存在溶剂使用成本高，回收困难及产品溶剂残留等问题。大多数含有丰富多糖的植物，细胞粗大且壁厚，使得多糖难以从细胞中扩散出来，采用复合酶协同作用于植物提取过程，可以促进多糖的溶出，过程条件温和，目标产物活性高，极大地提高多糖的提取率以及纯度［6］。
大枣中的蛋白质对大枣多糖的提取分离造成一定的影响，大枣多糖普遍存在于原生质中，而原生质又处于细胞壁和细胞间质的包裹下，鉴于这些特点，若选用含有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶的复合酶液来参与反应，就可以减少传质阻力，提高有效成分的提取率。
1 器材与方法
1.1 材料 大枣购于陕北延安市场，选用质地优良的干品粉碎。
1.2 试剂 中性蛋白复合酶液，酶活2 500 u·g-1，酶液中含有少量纤维素酶、淀粉酶，由宁夏夏盛实业集团有限公司提供。
1.3 仪器DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪予华仪器厂；LD4-2低速离心机：北京低速离心机厂；722型可见光分光光度计：上海第三分析仪器厂；HI 98107 酸碱度测试笔：美国哈纳仪器公司；RE-52AA旋转蒸发仪器：上海嘉鹏科技公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
1.4 分析方法多糖检测方法为苯酚硫酸法；数据处理法为加权平均法。
2 结果
2.1 不同提取方法的对比因为不同溶剂对大枣实体及其多糖的作用不同，所以用不同溶剂进行提取具有不同的结果。定量称取烘干枣粉20 g,采用添加总质量浓度1%果胶酶复合液（pH为7），纤维素复合酶液（pH为7），中性蛋白复合酶液（pH为7），40℃下提取2 h，共进行两次提取，并以传统水提法为参照，确立最佳提取方法，结果见表1。
表1 不同提取液的提取结果（略）
由提取结果可看出，果胶复合酶，纤维素复合酶参与提取与传统水提相比效果不是很显著，果胶酶得到较好的得率，但纯度反而下降，就是因为果胶酶在水解大枣中果胶质的同时又进而水解掉一部分多糖。而纤维素酶则在水解大枣纤维素使其结构变得松散的同时又直接将大枣中的糖蛋白和蛋白聚糖水解掉，直接导致得率下降。因此在大枣多糖提取中主要应用以上两种酶时并不能达到预期效果。中性蛋白复合酶参与提取效果显著，主要是因为中性蛋白酶对大枣中的游离蛋白质具有水解作用，且目标性强。鉴于上结果，本研究采用中性蛋白复合酶作为大枣多糖的提取剂。
2.2 中性蛋白复合酶最佳提取条件正交实验称取烘干枣粉20 g共9份，按正交设计表条件进行提取，提取液浓缩1∶3，体积分数80%醇沉，低温灭酶后，二次单纯采用去离子水提取2h，得多糖用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，真空干燥。利用正交实验对酶添加量、pH、温度等因素进行考察。实验因素水平见表2，最佳提取条件正交实验结果见表3。由极差结果得，3个因素对大枣多糖中性蛋白复合酶法提取的影响顺序为：B＞C＞A，由实验结果确立主要影响因素参数为B3C2A3，即最佳提取条件为：中性蛋白酶对底物质量浓度0.15%，加酶温度37℃，反应pH值7.5。
表2 正交实验因素水平（略）
表3 中性蛋白复合酶最佳提取条件正交实验结果（略）
2.3 大枣多糖的药理实验取实验最佳工艺所得大枣多糖，经精制沉淀后，用于以下药理实验。
2.3.1 大枣多糖急性毒性实验取ICR品系小鼠40只，雌雄各半，分为两大组；A组20只，B组20只，给予B组灌胃大枣多糖（药物以生理盐水稀释，最大质量浓度45% ）。每20 g体重灌胃0.4 ml，每隔4 h重复1次，共3次，观察动物死亡数和死亡时间。给与A组灌胃等剂量生理盐水。结果未见动物死亡，亦未见动物有其他反应。表明动物最大耐受量在27.0 g·kg-1以上，相当于原生药675 g·kg-1，属无毒级。
2.3.2 大枣多糖对S180实体瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响取ICR品系小鼠50只。将接种7 d的S180实体瘤腹水型小鼠，消毒腹部皮肤，断头处死，抽取腹水，稀释3倍后，接种于各小鼠左侧腋下，皮下接种，每只0.2 ml。接种后第2天，称重 ，按体重分层随即将小鼠分为A，B，C，D，E 5组，A组为S180实体瘤对照组，B，C，D组分别为大、中、小剂量大枣多糖组，E组为环磷酰胺组。分组后开始给药，A组以生理盐水灌胃，B，C，D组分别按剂量为675，225和75 mg·kg-1的大枣多糖药液灌胃；E组灌胃剂量为每只0.6 mg（30 mg·kg-1）。以上各组均连续用药7 d。
于第7天前72 h腹腔注射0.5%无菌淀粉盐水0.1 ml/只，于第7天再注射淀粉溶液1次，1 h后腹腔注射0.5%鸡红细胞0.1 ml/只，6 h后脱臼处死小鼠，取腹腔液涂片染色镜检。油镜下计数200个巨噬细胞，观察吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数目。结果以吞噬率表示。结果见表4。
表4 大枣多糖对S180实体瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（略）
结果表明，大枣多糖大、中、小剂量对S180小鼠巨噬细胞吞噬率均有不同程度的提高作用，其中大、中剂量组有显著作用，有效剂量为225 mg·kg-1，小剂量组提高不明显。
3 讨论
纯酶自身成本较高，酶的介入会直接增加大枣多糖提取的成本费用，而这种复合粗酶使用成本较低，其中还含有少量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、这些酶相互之间可以产生协同作用，无疑对大枣多糖的提取十分有利。其中的主要成分中性蛋白酶主要可以使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解掉，那么，原有的除蛋白工艺步骤可以省略，进而简化了提取工艺，同时也可以达到一个较好的提取效果。
【】
［1］ 医学院药物研究所.中药志，第3册［M］.北京:人民卫生出版社,1993:135.
［2］ 李淑子,张 本.大枣的化学和药理研究概况［J］.中草药,1983,14（10）：39.
［3］ 冉 靓,杨晓声,王伯初,等.抗氧化多糖的研究进展［J］.时珍国医国药，2006,17（4）:494.
［4］ 王 健,龚兴国.多糖的抗肿瘤及免疫调节研究进展［J］.中国生化药物杂志,2001,22（1）:52.
［5］ Paulsen, B. S. Plant polysaccharides with Immunostimulatory activities［J］. Current Organic Chemistry, 2001, 5：939.
［6］ Godfrey T.The application of enzymes in industry［M］.UK:The Nature Press,1983.
