补骨脂提取物对PI13K/Art信号通路影响的实验研究

【关键词】  补骨脂提取物 PI13K/Art信号通路

肿瘤的发生是多因素、多阶段、多步骤、多基因改变的结果，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。随着对肿瘤细胞生长、增殖、凋亡的分子机制研究的深入，信号转导通路成为了肿瘤靶向性和耐药逆转的亮点。近年的研究表明，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）在肿瘤信号转导中起着重要的调节作用。细胞在一系列内外因素的作用下，通过启动PI3K/Akt信号转导通路，诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡。在肿瘤细胞逃避抗癌药物的杀伤过程中，PI3K/Akt信号转导通路可能起了极其重要的作用，因此PI3K/Akt信号转导通路有望成为恶性肿瘤治疗的新靶点［1］。本研究组以往的研究结果显示，补骨脂提取物抗肿瘤转移的作用，但其作用机制还未完全明确，为了进一步探讨其作用机制，我们进行了补骨脂提取物对PI13K/Art信号通路影响的实验研究，现将结果报道如下。

    1  材料和方法

    1.1  药物制备

    补骨脂药材加10倍水浸泡2h，煎煮2h，稍冷过滤，药渣加8倍水煎煮2h，稍冷过滤，合并两次滤液，浓缩至1.0g（生药）/ml。

    1.2  动物模型的制备［2］

    取移植后8~10d的可移植性前胃鳞状细胞癌（FC）组织，制备成1×1010/L的细胞悬液，于小鼠右腋皮下注射细胞悬液0.2ml/只。

    1.3  动物分组及给药

    近交系615小鼠，雄性，6~8周龄，体重18~22g。由医学院肿瘤研究所提供，合格证号SCXK11-00-0005。小鼠接种瘤株后随机分为对照组和实验组，每组10只。其中，实验组动物于接瘤后第2天起每天灌胃给予补骨脂提取物2.0g（生药）/kg，连续6周；对照组灌胃给予等剂量的生理盐水。

    1.4  指标测试 

    1.4.1  转移抑制率测定  实验结束后解剖实验小鼠，取出肺脏，计数肺部总转移灶数。

    1.4.2  PI13K/Art的表达  转移灶数计数后解剖实验小鼠，取出肿瘤组织，免疫组化法测定PI13K/Art在胃癌细胞中的表达。

    1.5  结果判断

    选择5个高倍视野各计数500个肿瘤细胞，以细胞浆内或/和细胞膜上出现明显的棕黄色颗粒并且明显强于背景非特异性染色为染色阳性细胞。两个实验者双盲法计数阳性细胞，取平均值，按照FDA推荐的HerecpTest结果评分标准把结果分为0~+++。完全阴性为0分；超过10%的癌细胞染色，染色间断分布为+，记1分；超过10%的癌细胞弱到中度阳性，染色连续为十十，记2分；超过10%的癌细胞强阳性，染色连续+++，记3分。

    1.6  统计学分析

    数据以x ±s表示。用SPSS13.0进行方差分析，组间比较用t检验。

    2  结果

    实验结束后解剖小鼠可找到米黄色、边缘光整、类圆形结节，即为转移灶。计数记过可见，对照组转移灶数明显多于实验组转移灶数，两组比较差异具有显著性意义，P<0.05，提示补骨脂提取物对肿瘤转移有一定的抑制作用。对照组PI13K/Art表达计分明显高于实验组计分，两组比较差异具有显著性（P<0.05），提示补骨脂提取物可抑制PI13K/Art的表达。结果见表1。表1  两组实验结果比较注：* 与对照组比较，P<0.05。

    3  讨论

    转移是肿瘤恶性行为的特征性表现，也是临床失败的主要原因，控制转移成功与否是决定癌症患者生存预后的关键［3］。肿瘤转移过程牵涉到细胞脱落、浸润、迁移运行、着床、新生血管生成等。理论上讲，只要能够阻止上述一个或多个过程，就能抑制肿瘤转移。本实验组在以往的研究中发现，补骨脂提取物能够抑制促进体外肿瘤细胞的凋亡，并能够抑制体内肿瘤的转移，本实验结果也显示对照组转移灶数明显多于实验组（P<0.05），说明补骨脂提取物对肿瘤转移有一定的抑制作用，结合以往研究的结果推测，其抑制肿瘤转移的作用可能是通过促进肿瘤细胞凋亡实现的。

    PI3K/AKT信号转导通路作为细胞生长、增殖和抗凋亡的重要调节因素，在引起恶性肿瘤化学治疗和放射治疗抗拒中起着非常重要的作用。研究表明PI3K/Akt信号转导途径抗细胞凋亡作用可能与下面几种机制有关［4~6］：调节bcl-2家族成员的活性，促进bcl-2发挥抗凋亡作用；抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族成员的活化；抑制FKHR进入细胞核诱导FasL的表达，从而抑制细胞凋亡；防止线粒体释放细胞色素C及凋亡因子。本实验研究结果发现，补骨脂提取物能够抑制PI3K/Akt信号的表达，可推测补骨脂提取物促进细胞凋亡从而抑制肿瘤转移的作用可能与抑制PI3K/Akt信号转导途径有关。

【】
  1 夏曙，于世英.抑制PI3K/Akt通路提高HeLa细胞化疗效果的实验研究. 肿瘤防治研究，2006， 33（3）：156~158.

2 高进，薛克勋，赵雪梅，等.血卟啉激光治疗肿瘤后对肿瘤转移影响的实验研究.中华肿瘤杂志，1986，8：256.

3 杨建民. 中医药抗肿瘤转移机理的研究进展. 中医药学刊，2005，23（10） ：1869~1872.

4 Sakuntala WG， Julie L， Elisabeth B， et al. The Insulin-Like Growth Factor-I Receptor Kinase Inhibitor， NVP-ADW742， Sensitizes Small Cell Lung Cancer Cell Lines to the Effects of Chemotherapy. Clinical Cancer Research，2005，11（15）：1563~1571.

5 Gibson EM， Henson ES， Haney N， et al. Epidermal growth factor protects epithelial-derived cells from tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by inhibiting cytochrome c release. Cancer Res，2002，62（2）：488~496.

6 Bartling B， Tostlebe H， Darmer D， et al. Morawietz H. Shear stress-dependent expression of apoptosis-regulating genes in endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 278（3）：740~746.