酪氨酸酶抑制剂对生育期雌性大鼠的抗生育效应研究

                    作者：钟兴明 钟依平 齐诠 韦相才

【摘要】  目的：动物实验观察酪氨酸酶抑制剂对生育期雌性大鼠的抗生育效应。方法：将90只检查阴栓为阳性的小鼠随机分为3组，每组30只。低剂量组每日灌胃大豆异黄酮40mg.kg-1.d-1；高剂量组每日灌胃大豆异黄酮80mg.kg-1.d-1，正常对照组每日灌胃等量生理盐水。于D4观察囊胚和胚胎个数，D6观察着床胚胎数，D20剖腹检查活胎数。结果：D4正常对照组、低剂量组和高剂量组的囊胚发育率分别为84.8%（106/125），65.63%(84/128)， 62.4%（78/125）。D6正常对照组、低剂量组和高剂量组的平均着床胚胎数分别为5.25个，1.71个和1.33个。D20剖宫取胎，正常对照组、低剂量组和高剂量组的平均活胎数分别为4.6个，0.9个和0.7个。3组相比较，正常对照组的囊胚发育率、平均着床胚胎数和平均活胎数显著高于低剂量组和高剂量组（P＜0.05）。结论：大豆异黄酮作为一种酪氨酸酶抑制剂，可抑制生育期的雌性小鼠胚泡的发育和胚胎着床，但具体剂量和机制需进一步深入研究。

【关键词】  酪氨酸激酶； 大豆异黄酮； 抗着床

酪氨酸激酶（tyrosine protein kinase ,PTKs）是一组酶系，是在正常和异常增殖过程中起重要作用的癌蛋白和原癌蛋白家族中的成员。多种生长因子包括表皮生长因子（EGF）、血小板源生长因子（PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）的受体都有PTKs活性。PTK途径的激活属于与细胞的生长、增殖和分化有关的信号途径。目前，PTK抑制剂在医学上的应用主要是抗肿瘤。近来研究还发现PTKs的活性与非肿瘤细胞的生理活动有关，许多PTKs抑制剂能影响正常细胞的功能和机能，在这一方面研究较多的是一些发现较早的天然化合物如染料木黄酮（genistein，GST）、herbimycin  A和lavendustin A。大量的研究已证实，GST在防治癌症、降低血脂、妇产科的激素替代、激素依赖性肿瘤的防治方面有着广阔的应用前景［1］，但对于抗生育方面的研究较少。本研究通过小鼠动物实验观察大豆异黄酮对青年雌性大鼠生育功能的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  性成熟期的健康昆明小白鼠，清洁级，雌性100只，6～8周龄，体重25～30g，连续观察两个动情周期均正常；雄鼠15只，3～4月龄，体重大于30g，雄鼠均采用单笼饲养；喂养颗粒饲料，光照周期12 L:12 d，自由摄食饮水。由南方医科大学动物中心提供。

    1.1.2  受试物  大豆异黄酮类提取物，由某生物制品公司提供。总的异黄酮含量为22%，其中大豆黄酮9.5%，大豆甙元1.5%，金雀异黄酮10.3%，金雀异黄素(genistein)0.7%,总的游离甙元(有效生物浓度)含量14.4%。动物实验用剂量徐叔云“药理实验方法”［2］。

    1.1.3  试剂及仪器  二甲亚枫(dimethylsulfoxide, DMSO)购自生工生物工程(上海)有限公司；实验用M2囊胚培养液由中山大学转基因动物实验室提供(为Sigma产品)。

    1.2  试验方法及内容

    1.2.1  动物适应性饲养  实验动物在中山大学北校区动物中心二级实验动物房（温度20～24℃，湿度40%～70%，12 h明暗交替）单笼饲养适应1 w。

    1.2.2  实验步骤  ①雌雄小鼠2∶1合笼，次晨检查阴栓，阳性者定为妊娠第1天，记为D1。其中，100只雌性小鼠中有92只次晨检查阴栓为阳性。随机将其中90只分为3组，每组30只。　每日上午连续灌胃相应剂量药物。低剂量组每日灌胃大豆异黄酮40mg.kg-1.d-1；高剂量组每日灌胃大豆异黄酮80mg.kg-1.d-1，按灌胃量为1 ml.150 g-1.d-1配制。正常对照组每日灌胃等量生理盐水。于D4下午用颈椎脱臼法每组处死1/3小鼠，取出输卵管、子宫。自输卵管伞端及子宫与输卵管连接处用预平衡过夜的M2培养液灌注冲出胚胎，用显微操作系统中的倒置显微镜(德国Leica公司)观察囊胚形态学、统计胚胎个数，计算囊胚发育率，留取子宫待检。②每组的另1/3小鼠于D6用颈椎脱臼法处死，处死前5min从鼠尾注射1%的芝加哥蓝B染液0.1ml，肉眼观察着床胚胎数(子宫壁上每出现一条蓝色深带为一处胚胎着床点)，统计每组着床胚胎总数及妊娠率［3］。③将每组剩余1/3小鼠继续按相同方法喂养，于第20d处死并称重，剖腹取出子宫和胎鼠，检查死胎和活胎数。

    1.3  数据处理与统计

    所有数据以SPSS10.0软件包建库并计算各组各指标的平均值，进行均数和方差分析。

    2  结果

    2.1  大豆异黄酮对胚泡在体内发育的影响

    光镜下，3组共获取胚胎378个，其中正常对照组为125个，低剂量组为128个，高剂量组为125个。3组相比较，获取胚胎总数无显著差异（P＞0.05）。其中，正常对照组见106个胚胎发育成囊胚，囊胚发育率为84.8%（106/125）；低剂量组见84个胚胎发育成囊胚,囊胚发育率为65.63%(84/128)；高剂量组见73个胚胎发育成囊胚，囊胚发育率为62.4%（78/125）。3组相比较，正常对照组的囊胚发育率较低剂量组和高剂量组显著增高（P＜0.05），而低剂量组的囊胚发育率和高剂量组相比较无显著差异（P＞0.05）。

    2.2  大豆异黄酮对胚胎着床的影响

    3组共获得孕鼠18只。其中正常对照组8只，妊娠率为80%；低剂量组为7只，妊娠率为60%；高剂量组为3只，妊娠率为30%。3组相比较，高剂量组的妊娠率显著低于正常对照组和低剂量组（P＜0.05）。正常对照组和低剂量组的妊娠率相比较无显著差异（P＞0.05）。3组共获得的着床胚胎总数为58个，其中正常对照组为42个，平均着床胚胎数为5.25个；低剂量组着床胚胎总数为12个，平均着床胚胎数为1.71个；高剂量组着床胚胎总数为4个，平均着床胚胎数为1.33个。3组相比较，正常对照组的着床胚胎总数和平均着床胚胎数显著高于低剂量组和高剂量组（P＜0.05）。

    2.3  大豆异黄酮对胎鼠的影响

    剖宫取胎后共获得活胎62个，均未见死胎和畸胎。其中正常对照组为46个，平均活胎数为4.6个，低剂量组为9只，平均活胎数为0.9个，高剂量组为7只，平均活胎数为0.7只。3组相比较，正常对照组的活胎总数和平均活胎数显著高于低剂量组和高剂量组（P＜0.01）。

    3  讨论

    大豆异黄酮是一种黄酮类的PTKS抑制剂，其中包含大豆黄酮、大豆甙元、金雀异黄酮和金雀异黄素（genistein）等。国内研究表明，大豆异黄酮提取物对酪氨酸酶活性有比较强的抑制作用，并且随着大豆异黄酮提取物浓度的提高，其对酪氨酸酶活性的抑制率也提高［4］。Genistein是ATP与PTK结合的竞争性抑制剂，能有效地抑制EGF酪氨酸激酶。现有学者发现，在黄体细胞的体外培养中，应用PTK抑制剂不仅可明显拮抗EGF升高孕酮的作用，而且在小鼠的胚泡体外发育和胚胎移植的过程中可明显抑制胚胎着床［5］。另外，从结构上讲，genistein属于一种植物雌激素［6］，既能代替雌激素和ER结合，发挥雌激素样作用，又能干扰雌激素和ER结合，表现抗雌激素作用，具有双向性。Dechaud H研究发现，genistein可以与3H标记的雌二醇竞争性地结合性激素型球蛋白，从而干扰雌激素与其受体结合，破坏体内的激素平衡。通过动物实验发现，动物摄入过量的植物雌激素，能干扰促性腺激素释放的反馈系统，导致生育问题［7］。近年来对灵长类胚泡着床的研究表明，着床期子宫内膜也需要基础水平的雌激素，而且孕激素受体的表达有赖于雌激素的诱导，因此利用小剂量genistein的抗雌激素作为抗着床的可能性是存在的。赵更力［8］的研究表明，应用大豆异黄酮后,内膜表现出不同程度的增生、子宫重量明显增加，而且子宫重量系数和内膜增生程度与大豆异黄酮的剂量有关，表明大豆异黄酮具有雌激素样作用并且作用强度与剂量有关，大剂量大豆异黄酮引起子宫内膜的增生反应明显。本实验结果显示，在喂养不同剂量的大豆异黄酮后，D4获取的胚胎总数和囊胚的发育率较对照组显著降低（P＜0.05）；D6获得的胚胎着床数和平均着床胚胎数较对照组显著降低（P＜0.05）；D20获得的活胎总数和平均活胎数也较对照组显著降低（P＜0.01）。说明大豆异黄酮对生育期雌性小鼠存在着明显的抗生育效应。迟晓星等［9］认为大豆异黄酮对青年雌性大鼠体质量的影响不显著，但高剂量组大鼠的卵巢发生了病理变化，主要表现为卵泡增多，体积增大，卵泡内颗粒层细胞增多，厚度增加，卵泡液丰富。推测在300 mg/kg·bw的剂量下，大豆异黄酮可能会对青年雌性大鼠卵巢产生影响。Genistein与E2一样，在低浓度时促进黄体酮的合成，高浓度时则抑制其合成［10］。Genistein对于年轻动物、雌激素化的动物及年轻妇女等高雌激素水平者，表现为抗雌激素活性，而在E2较低的绝经和手术绝经的妇女则显示雌激素样作用［11］。有研究发现，青年妇女每天服用异黄酮45mg，月经周期推迟1.5天，卵泡相延长2.5天，黄体相缩短1天。因而，从理论上推测genistein作为PTKS抑制剂一方面可干扰着床时细胞因子的信号转导，破坏蜕膜组织的细胞因子平衡；另一方面对体内高雌激素水平的生育期雌性小鼠还具有抗雌激素作用，故其具有抗着床作用。本研究结果还显示，大豆异黄酮虽可抑制胚泡发育和胚胎着床，但对于着床后的胚胎发育却无明显影响，剖宫取胎未发现死胎或畸胎。综上所述，大豆异黄酮作为黄酮类的PTKS抑制剂，对生育期雌性小鼠具有一定的抗生育作用。但具体的抗着床剂量及机制，还需进行更深入的研究，为新型避孕药物的研究及开发提供理论及实验支持。

【】
  1 Arena S , Rappa C, Del Frate E，et al . Anatural alternative to menopausal hormone replacement therapy . Phytoestrogens. Minerva Ginecol , 2002 , 54(2):53～58.

2 徐叔云,卞如濂，陈修.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991，178～80.

3 范立青，卢光琇，卢惠霖.表皮生长因子受体特异的酪氨酸酶抑制剂对小鼠胚泡体外发育和胚胎着床的影响.生殖与避孕，1997，17（6）：365～366.

4 魏振承，孙玲，张雁，等.大豆异黄酮对酪氨酸酶抑制作用的研究.广州食品科技，2004，20（3）：10～11.

5 Lachgar S,Moukadiri H,Jonca F , etal . Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor for hair dermal papilla cells . J Invest Dermatol ,1996，106(1):17～23.

6 Arcuri F, Ricci C, Ietta F, etal . Macrophage migration inhibitory factor in the human endometrium:expression and localization during the menstrual cycle and early pregnancy. Biol Repord , 2001,64(4):1200～1205.

7 杨志华，综述；沈倍奋，审阅.gp130的结构、功能及信号传导.国外医学分子生物学分册，2000，22（4）：217～222.

8 赵更力，江元慧，张小松，等.不同剂量大豆异黄酮对去势大鼠子宫内膜的影响.预防医学杂志，2005，6（3）：193～195.

9 迟晓星，张涛，崔洪斌，等.大豆异黄酮对青年雌性大鼠的副作用研究.食品科技，2008，2：246～248.

10 Tanaka T, Sakamoto T, Miyama M,etal. Interleukin-11 enhance cell survival of decidualized normal human endometrial stromal cells. Gynecol Endocrinol ,2001,15(4):272～278.

11 Loke YW, Burrows TD , King A. Adhesion molecules and trophoblastic invasion. Contracept Fertil Sex , 1995,23(9):573～575.