基于正交实验优化创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白的表达
【摘要】 目的： 对创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白表达条件进行优化，从而获得高效稳定的金属蛋白酶原核表达系统。 方法：质粒pET-32a-vvp转化E.coliBL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计，对结果进行直观分析及方差分析，并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。 结果： 直观分析表明摇菌转数的R值最大，其次为诱导时间和诱导温度，诱导剂IPTG浓度的R值最小；方差分析表明摇菌转数的P值小于0.05，而时间因素、温度及IPTG浓度的P 值均大于0.05。结论： 摇菌转数为主要因素（其为250r/m时,表达水平最高），其次为诱导时间，而诱导温度和诱导剂IPTG浓度对实验结果影响不明显。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下，金属蛋白酶的表达量高达40.67%。
【关键词】 创伤弧菌； 金属蛋白酶； 正交设计； 直观分析； 方差分析
Abstract Objective: To optimize the expression of recombinant metalloprotease of Vvibrio vulnificus in E.coliBL21/DE3 induced by IPTG. Method: The plasmid of pET-32a-vvp/E.coliBL21 was constructed by our laboratory. Four different factors,including time, temperature, agitation speed and concentration of IPTG, were studied by orthogonal experimental design. The data were analyzed by direct calculation and ANOVA method. Results: The R value of agitation rate resulting from direct calculation was highest among four factors. The P value of agitation rate was lower than 0.05. The P value of the other factors were higher than 0.05. Conclusions: The expression level is remarkable affected by the agitation rate. The expression level of VVP protein is highest when agitation rate is 250 rpm. Therefore we have established a method for high-level expression of VVP-four hours-inducing time, 37℃-inducing temperature, 1mmol/L concentration of IPTG and agitation rate in 250rpm.
Key words vibrio vulnificus; metalloprotease; orthogonal experimental design; direct analysis; analysis of variance(ANOVA)
很多临床病例及动物实验已经证明，进食被创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）污染的食物或者皮肤破损接触Vv均可引起Vv感染，主要表现为严重的蜂窝组织炎和败血症［1~3］。一旦出现败血症，其死亡率高达50%以上［4~6］。因其病情凶险,故对创伤弧菌感染的临床早期快速诊断尤为重要。目前,Vv的致病机制尚未明了。但有研究表明该菌分泌的金属蛋白酶（VVP）具有增加血管通透性，引起出血性损伤的作用，已被证实是创伤弧菌的主要毒力因素之一［7~9］，并且vvp基因在不同创伤弧菌菌株之间具有高度保守性。故金属蛋白酶可作为创伤弧菌感染重要的临床实验室检测靶标。而要制备以VVP为靶标的Vv免疫检测试剂盒，首先必须获得作为足量高纯度的VVP抗原来制备抗体。但是金属蛋白酶作为创伤弧菌种特征性的外毒素，其分泌产量并不高,且由于方法学的限制,采用常规生化方法获得足量高纯度溶细胞素相当困难。而通过基因工程的方法，我们可以在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有价值的蛋白质，对其应用或进行功能的研究。但是外源基因在工程菌中的诱导表达受很多因素的影响，例如，诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及摇菌的转数等。因此，如何得到一种最佳的诱导条件组合，从而使蛋白高效稳定的表达是我们研究的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
原核表达载体pET-32a-vvp由本课题组构建；宿主菌E.coliBL21/DE3由南方医科大学公共卫生与热带医学学院吴昆博士惠赠。
1.1.2 诱导剂IPTG和筛选用氨苄青霉素
购自鼎国生物制品有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验设计
针对诱导过程中对菌体表达蛋白产生影响的4个因素诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用SPSS 11.5统计学软件进行正交实验设计。因素及水平见表1。表1 因素水平表（略）
1.2.2 诱导
质粒pET-32a-vvp转化E.coliBL21/DE3后,挑取单菌落接种于含氨卞青霉素(100mg/L)的LB培养基中,37℃活化过夜,次日按1:100的比例转接,37℃培养至OD600约0.8时即根据不同诱导条件进行诱导,诱导条件见实验设计。离心收集菌体,做SDS-PAGE分析,考马斯亮蓝染色、脱色后观察。扫描后运用图像分析软件Quantity One得出各不同诱导条件下融合蛋白VVP的表达浓度。
1.2.3 正交试验直观分析法
分别每个因素各水平下的平均收率，用各因素各个水平平均收率的极差R(极差=平均收率的最大值- 平均收率的最小值)来反映各因素的水平变动时对试验结果影响的大小［10］。
1.2.4 方差分析
运用SPSS 11.5统计学软件对正交设计资料进行分析。
1.2.5 结果验证
在由上述方法得出的最佳诱导条件下，对转化了质粒pET-32a-vvp的E.coliBL21/DE3进行诱导，并对结果进行SDS-PAGE分析，以验证此组合的诱导条件的诱导表达效果。并设置转化空载体组及未诱导组进行对照。
2 结果
2.1 SDS-PAGE 结果
取16组经不同诱导条件诱导的菌液作组间平行SDS-PAGE,经Quantity One对染色凝胶做图像分析,来确定融合蛋白VVP表达的相对比例。SDS-PAGE 结果见图1，图上方的数字代表组别。经扫描得到各组VVP的表达比例见表2。
2.2 优化结果
2.2.1 正交试验直观分析法
运用正交试验直观分析法得出的条件优化结果见表2和图2，K1、K2、K3、K4分别表示每个因素各水平下的蛋白表达量的均值［10］。由极值R的大小推知,各因素的重要性依次为诱导摇菌转数、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。表2 实验设计与结果分析（略）
2.2.2 方差分析
运用SPSS 11.5统计学软件对进行正交设计资料进行方差分析得出的条件优化结果见表3。摇菌转数的P值小于0.05,即该因素对试实验结果影响显著；而时间、温度及IPTG浓度的P 值均大于0.05。表3 方差分析表（略）
2.2.2 结果的验证
在诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L的情况下，VVP的表达量达到了40.67%。而其它4组对照组均无表达，见图3。
3 讨论
正交试验设计是一种安排多因素多水平试验,并利用普通的统计分析方法来分析试验结果的一种试验设计方法［10］。对于多因素多水平的问题,通常都希望通过试验找出因素的主次关系和最优搭配条件。用正交设计合理地安排试验,可以做到省时、省力、省钱,同时又能得到基本满意的试验效果［10］。因此在本研究中，我们运用这种实验设计方法对融合蛋白VVP在工程菌中的诱导表达条件进行优化，旨在获得稳定高效表达的VVP蛋白，从而为VVP的致病机理研究以及Vv免疫检测试剂盒制备奠定基础。
目的基因在大肠杆菌中的诱导培养方式主要有两种，即化学物质诱导和温度诱导，pET32a载体带有启动子T7lac，可采用化学物质IPTG进行化学诱导［11］。要实现蛋白产物的高表达，需要考虑重组菌生长和产物表达的最适环境条件，包括诱导时间、诱导温度、摇菌的转数及最适诱导剂浓度等。细菌在诱导后，大量能量会消耗在外源蛋白的表达上，使细菌的生长提前进入衰亡期，过度诱导会造成溶菌。因此需要对诱导时间进行控制，找到能使外源蛋白充分表达而又不会导致溶菌的适当诱导时间，我们在实验中设计了3个连续的时间水平1h、2h、3h。在诱导温度上，不同的蛋白对温度有不同的要求。有研究表明，有些外源蛋白在低温下才能大量表达［12］；而本实验中的工程菌大肠杆菌的最适生长温度是37℃。考虑到这两方面的要求，我们在实验中设计了3个温度水平：20℃、30℃、37℃。摇菌的转数对细菌的生长也是极为重要的。体系溶解氧是影响菌体代谢的重要参数,外源基因在高效转录和翻译时需要大量能量,及时给予饱和需氧量对高效表达有意义［13］。加入诱导剂后通过改变搅拌转数(r/min)来改变氧传递推动力和液相体积氧传递系数,以达到调节体系溶解氧的目的。通常搅拌转数愈大液相体积氧传递系数愈大,但当r/min 很大时,体系产生不可避免的泡沫而阻止了氧的传递;同时r/min过大则产生较大的剪切力,亦对菌体生长不利［11］。我们在实验中设计了3个r/min水平：100、180、250。诱导剂IPTG的浓度对外源蛋白的表达水平有较大影响，浓度过高会对宿主菌造成损害，过低则影响诱导剂的效用。因此实验中设计了4个浓度水平:0.1mmom/L、0.5mmom/L、1mmom/L、2mmom/L。
本实验设计的因素水平不等，因此在对正交设计资料进行直观分析时，我们运用平均蛋白表达量K1、K2、K3值的大小来反映各因素的不同水平对实验结果(蛋白表达量)影响的大小,并以此确定实验的最佳搭配。用各因素各个水平蛋白平均表达量的极差R来反映各因素的水平变动时对实验结果影响的大小。极差大的就表示该因素的水平变动时对实验结果的影响大,极差小的就表示该因素的水平变动时对实验结果的影响小。本实验中，我们得到因素的主次顺序为诱导摇菌转数、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。主要因素应取较好的水平，而次要因素,则可根据对成本、时间、收益等方面的统筹考虑而选取适当的水平。正交试验的直观分析法简便、直观、量小,但不能估计试验误差，即不能区分是由于各因素的水平变化而导致试验结果的差异,还是由于试验的随机波动而导致试验结果的差异。为解决此问题,可对试验结果做方差分析。由表3可知，摇菌转数的P值小于0.05，而时间、温度及IPTG浓度的P 值均大于0.05。按方差分析法的观点，只须对有显著意义的因素确定好水平,而其它对试验结果没有什么影响的因素,则可按实际需要来确定适当的水平。方差分析的结果与直观分析方法得到的结果相同。并且这一结果也通过VVP的高表达(表达浓度达到了40.67％)得到了验证。由此得本研究的试验最佳组合为摇菌转数250rpm、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。
【】
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