Minitab软件在多杀菌素发酵条件优化中的应用

【摘要】  利用Minitab软件，采用响应面方法(response surface methods，RSM)对多杀菌素发酵条件进行优化。通过Plackeet?Burman设计实验，从培养基中筛选出显著性影响因子：葡萄糖、棉籽粉、玉米浆的浓度以及初始pH，并确定非显著影响因素的水平；采用中心组合设计，对四个显著影响因素进一步的优化，根据建立的多元二次方程确定其最佳水平，得到最佳的培养条件(g/L)：葡萄糖68.5，麦芽糖10，棉籽粉26.0，玉米浆17.8，牛肉膏2.0，硫酸锌0.2，硫酸铵1.5，CaCO3 5；接种量10%，初始pH7.0，摇床转速220r/min，培养7d。在此条件下，多杀菌素的产量为175mg/L，比优化前(120mg/L)产量提高了45.8%。

【关键词】  多杀菌素； Minitab软件； 响应面方法(RSM)； 优化

    ABSTRACT  Using response surface methods with the aid of Minitab software, the fermentation materials were investigated and optimized. The significant impact factor of the different fermentation conditions were screened and identified by Plackeet?Burman experimental design. The level of significant factors were further optimized using central composite design. From the resulting of multi?quadratic equation, the optimized levels of influencing factors could be established. The optimized medium was as follows: glucose 68.5 g/L; maltose 10 g/L; cottonseed meal 26.0 g/L; corn steep liquor 17.8 g/L; beef extract 2.0 g/L; zinc sulfate 0.2 g/L; ammonium sulfate 1.5 g/L; CaCO3 5 g/L and the pH adjusted to 7.0. The optimized culture condition: shaker speed 220 r/min; inoculum size 10% v/v; and cultivated for 7 days. The production titer of this condition in shake?flask reached 175 mg/L, which was increased by 45.8% compared with the previous condition.

    KEY WORDS  Spinosad;  Minitab software;  Response surface methods;  Fermentation optimization

   多杀菌素(spinosyn A和D的混合物)是一种新型生物农药，可以有效的防治鳞翅目害虫［1～3］，不仅杀虫活性高，与化学农药相当，而且半衰期短，降解完全，对动物和昆虫天敌安全［4］，家们对其生物学特性和生物防治的应用条件进行了大量的研究［5，6］。目前多杀菌素的生产都是放线菌刺糖多孢菌经有氧发酵得到的，而改善发酵培养条件，使生产菌的性状得以充分高效的表达，是提高次级代谢物产量的有效途径。为了找到一个快速有效而且简单的统计软件对发酵培养基和工艺条件进行优化，本文尝试使用Minitab软件。该软件不仅可以进行Plackeet?Burman和中心组合(Centralcompositedesign)等实验设计， 而且包含对应实验的方差分析，回归分析和模型方程的拟合，不用编程和就能快速而有效的找出主要影响因素以及各因素间的交互作用，软件自动生成的二维和三维图可以帮助我们直观的分析各因素间的关系，最终得到合理的最佳组合。建立的回归方程还能对实验结果进行预测，进一步检查实验设计和结果的准确性。整个优化过程，从实验设计到结果分析，从方程拟合到图形建立，在Minitab软件中都能很好的实现。近年来，Minitab软件在国外已经被广泛的应用在质量控制、管理和科研等领域，国内仅有关于其使用方法的报道［7］，关于应用的报道还很少。本文利用Minitab软件对生物农药多杀菌素的发酵培养条件进行优化。

    1  材料和方法

    1.1  菌种

    刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)U?4213，本实验室保藏。

    1.2  培养基

    斜面培养基(g/L)  葡萄糖10，N?Z?Amine A 30，酵母膏1.0，牛肉膏1.0，琼脂15；pH7.0～7.5(用NaOH调节)。

    种子培养基(g/L)  葡萄糖10，N?Z?Amine A 30，酵母膏3.0；pH7.0～7.5(用NaOH调节)。

    初始发酵培养基(g/L)  葡萄糖60，麦芽糖10，棉籽粉20，玉米浆15，硫酸锌0.2，硫酸铵1.5，CaCO3 5；pH7.0～7.5(用NaOH调节)。

    1.3  培养方法

    (1)菌种活化和种子培养  将4℃保藏的斜面菌种转接到新鲜的斜面上，30℃生化培养箱中培养7～10d；取一环斜面活化菌种接入30ml种子培养基，在30℃温度下220r/min摇床中振荡培养60h。

    (2)发酵培养  取种子培养液以10%的接种量接入30ml发酵培养基，在30℃温度下220r/min摇床中振荡培养7d，每个样品做3个平行样，结果取平均值。

    摇瓶培养实验的装液量均为30ml的培养基于250ml的锥形瓶中。

    1.4  产物检测方法

    取5.0ml同批发酵液，加入5.0ml甲醇，充分振荡，超声波处理15min，室温浸提12h；5000r/min离心10min；取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱分析(HPLC)。色谱柱为LabAlliance C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测器为UV检测器(Model 500，美国)，波长246nm；流动相为甲醇∶乙腈∶乙酸铵水溶液(1%，w/v)=40∶55∶5(v/v)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl。

    1.5  响应面方法设计实验

    利用Minitab软件设计实验和对实验结果进行分析。设计Plackeet?Burman(PB)实验，从发酵培养基和工艺条件的一些因素中筛选出对多杀菌素产量有重要影响的因素；通过中心组合实验设计，对PB筛选实验中确定的显著性影响因素进一步的优化，得到多杀菌素产量达到最大时的最佳培养条件。

    (1)Plackeet?Burman(PB)实验设计和结果分析方法  根据单因素的实验结果和报道，选取发酵培养基组分和工艺条件中的8个因素作为考察对象，每个因素取高、低两个水平，分别记做1和-1，在Minitab软件中，按照Minitab→Stat→DOE→Factorial→Create Factorial Design→Plackeet?Burman的顺序设计12次的Plackeet?Burman实验；按照实验设计进行实验。

    在Minitab软件中，按照Minitab→Stat→DOE→Factorial→Analyze Factorial Design的顺序对实验结果进行分析。

    (2)中心组合实验设计和结果分析方法  在Minitab软件中，按照Minitab→Stat→DOE→Response Surface→Create Response Surface Design→Central composite的顺序，对PB实验筛选得到的显著性因素进一步优化，进行4因素5水平的31组中心组合设计实验，设计实验的中心点编码为0，0，0，0，实验的实际浓度选取PB实验中高低水平浓度的中点值，即葡萄糖70g/L，棉籽粉25g/L，玉米浆15g/L，初始pH7.2，其余的非显著因素浓度取初始培养基的配方值。

    2  结果与讨论

    2.1  Plackeet?Burman筛选实验

    按照1.5(1)的实验设计方法考察葡萄糖(X1)，麦芽糖(X2)，棉籽粉(X3)，玉米浆(X4)，硫酸锌(X5)，硫酸铵(X6)，接种量(X7)和初始pH(X8)8个因素对响应值Y(多杀菌素产量)的影响，各因素的水平和实验结果见Tab.1和Tab.2。

    按1.5(1)的方法对实验数据进行分析，得到各因素对响应值的影响效应如Tab.3所示。

    从Tab.3可以看出，在多杀菌素的发酵生产中，X1、X3、X4和X8是主要的影响因素，在95%的概率水平上影响显著。X2和X5的影响为负效应，应当取其低水平，X6和X7的影响为正效应，取其高水平，因此根据PB实验结果可以初步确定非显著影响因素的水平：即麦芽糖10g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸铵1.5g/L，接种量10%。

    2.2  中心组合实验设计及结果

    按照1.5(2)确定的各因素编码水平和实验设计方法设计中心组合实验，各因素编码水平及实验结果分别见Tab.4和Tab.5。

    2.3  响应面分析

    利用Minitab软件，按照Minitab→Stat→DOE→Response Surface→Analyze Response Surface Design的顺序，对中心组合设计实验结果进行响应面分析，分析结果见Tab.6所示。从表Tab.6中可以看出，X1、X2、X3和X4即葡萄糖、棉籽粉、玉米浆和初始pH四个因素对多杀菌素产量都有显著的影响，而且线性和曲面效应都很显著。

    2.4  响应面方程的建立

    根据实验分析结果得到的各因素效应系数，建立多杀菌素产量对四个显著影响因素的多元二次方程，如式(1)所示。对方程进行方差分析结果见Tab.7所示。

    Y=-21046+106.803333α+83.780771β+

    159.691778γ+4294.930804δ-0.767869α×α

    +0.380000α×β-2.134358β×β+0.070000α

    ×γ+0.115625β×γ-1.170108γ

    ×γ-1.825000δ×α-0.104167δ×β

    -17.953125δ×γ-274.605655δ×δ(1)

    该回归方程的相关系数为R2=0.970，只有3%的数值失拟，说明该模型方程能够较好的用于多杀菌素的发酵培养基组分及其产量的预测。从回归方程的方差分析可以看出，模型的回归效果高度显著，说明该模型能够很好的拟合实验数据，另外，回归方程的一次项、二次项的影响显著，说明RSM法所选的因素对多杀菌素产量影响的效应显著。

    在Minitab软件中，按照Minitab→Stat→DOE→Response Surface→Contour Surface(Wireframe)Plots的顺序，设置不同的因素，就可得到软件自动生成的响应值与任意两个因素关系的响应面图和对应的等高线图，Fig.1给出了多杀菌素产量与葡萄糖浓度以及玉米浆浓度的响应面图和等高线图。

    由Minitab软件中2因素响应面图可以看出，在实验范围内，多杀菌素产量存在最大值。对所得的回归方程分别求四个变量的一阶偏导数,并令其为0，得到四元一次方程组,求解即可得到多杀菌素产量取得最大值时的最佳培养条件：葡萄糖浓度68.5g/L，棉籽粉浓度26.0g/L，玉米浆浓度17.8g/L，初始pH7.0，此时多杀菌素产量为168mg/L。

    2.5  回归模型实验验证

    经过实验设计和结果分析得到优化培养基配方(g/L)：葡萄糖68.5，麦芽糖10，棉籽粉26.0，玉米浆17.8，牛肉膏2.0，硫酸锌0.2，硫酸铵1.5，CaCO3 5。培养条件：接种量10%，初始pH7.0，摇床转速220r/min，培养7d。在此培养条件下进行多杀菌素的发酵实验，得到多杀菌素的产量为175mg/L，与优化前(120mg/L)相比产量提高了45.8%，与模型预测值168mg/L之间的误差<5%。

    3  结论

    (1)采用响应面方法(RSM)对初始发酵培养基进行优化后的发酵培养基为(g/L)葡萄糖68.5，麦芽糖10，棉籽粉26.0，玉米浆17.8，牛肉膏2.0，硫酸锌0.2，硫酸铵1.5，CaCO3 5。培养条件为接种量10%，初始pH7.0，摇床转速220r/min，培养7d。在此培养条件下进行多杀菌素的发酵实验，得到多杀菌素的产量为175mg/L，与优化前(120mg/L)相比产量提高了45.8%。

    (2)将Minitab软件用于生物农药发酵培养条件的优化中，集实验设计、结果数值分析、图表直观分析、模型方程回归于一体，体现了一种工具多种功能利用的时效性，不但减少了工作量，使实验设计和分析简单

    Note: C1: Concentration of Spinosad;  C2: Concentration of Glucose;  C3: Concentration of Corn Steep Liquid

    Fig.1    3D and isoresponse contour plot of response surface function化，而且取得了较传统优化方法更好的实验结果，为多杀菌素等抗生素发酵培养条件优化软件的应用提供了新的思路。

【】
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