毛细管电泳高频电导法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量
【摘要】 目的 建立夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。方法 以布洛芬为内标，采用毛细管区带电泳，高频电导检测；未涂层弹性融硅石英毛细管柱55 cm×75 μm ID，有效长度46 cm；1.2 mmol/L三乙胺?HCl（pH=10.60）， β?环糊精（0.08 mmol/L）为运行缓冲液；分离电压12.5 kV；重力进样10 s（高度20 cm）。结果 齐墩果酸、熊果酸线性范围分别为4.1～114.8 μg/mL（r=0.9995）和4.3～120.4 μg/mL（r=0.9996）；平均回收率分别为96.7%和98.2%。结论 该法简便、准确、快速、重现性好，可用于夏枯草药材中齐墩果酸和熊果酸的含量测定。
【关键词】 毛细管电泳；高频电导检测；夏枯草；齐墩果酸；熊果酸
Abstract:Objective To establish a method for determining the content of oleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris. Methods Capillary electrophoresis with high frequency conductivity detector was used to analyze the sample. The separation was performed on a uncoated fused silica capillary of 55 cm×75 μm（46 cm effective length）using 1.2 mmol·L-1 triethylamine as washing buffer (containing 0.08 mmol·L-1 β?cyclodextrin, pH 10.60). The voltage was 12.5 kV and temperature was 25 ℃. The sample was injected by gravity（10 s，20 cm）. Results The linear ranges of oleanolic acid and ursolic acid were 4.1～114.8 μg/mL（r=0.9995）and 4.3～120.4 μg/mL（r=0.9996）, respectively. The average recoveries of oleanolic acid and ursolic acid were 96.7% and 98.2%, respectively. Conclusion This method is reliable，rapid and accurate, which could be used for the quantitative analysis of the contents of oleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris.
Key words:capillary electrophoresis；high frequency conductivity detector；Prunella vulgaris；oleanolic acid；ursolic acid
夏枯草为中医临床常用中药，味辛、苦，性寒，具有消火、明目、散结、消肿的作用，用于目赤肿痛、目珠底痛、头痛眩晕、高血压等［1］。夏枯草中含有多种三萜类成分，以齐墩果酸（oleanolic acid， OA）和熊果酸（ursolic acid，UA）的含量较高，OA和UA属于构造异构体，在分离时具有一定难度。目前有关的含量测定方法有薄层色谱法［2］、高效液相色谱法［3,4］、气相色谱法［5］、毛细管胶束电动色谱法［6］等检测方法。本文采用毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis,CZE），高频电导（high frequency conductivity detection）检测的方法［7］，对不同产地夏枯草药材中OA和UA的含量进行测定，为药材质量控制提供了可借鉴的依据。
1 仪器与试药
CES2003毛细管电泳仪，包括高压电源、高频电导检测器及毛细管电泳数据工作站（中山大学化学与化学工程学院研制）。ORION MODEL 828型pH计（美国）。DL?360超声波清洗器（宁波石浦海天仪器厂），工作频率（4.5±5%） kHz，输出功率240 W。未涂层弹性融硅石英毛细管柱（75 μm ID，河北永年锐沣色谱器件有限公司）。
夏枯草样品（批号1：购自河南；批号2：购自安徽；批号3：购自贵州），均经广东药学院中药鉴定教研室房志坚副教授鉴定为真品。将其粉碎，于60 ℃下干燥4 h，置干燥器内备用。定量方法学考察采用的样品购自河南。
齐墩果酸对照品（批号：110709—200505）、熊果酸对照品（批号：110742—200516）、布洛芬对照品（批号：100179—200303）均由药品生物制品检定所提供，β?环糊精（中国医药集团上海化学试剂公司），三乙胺等试剂均为分析纯，水为去离子水（电阻为16.6 MΩ·cm-1）。
2 实验部分
2.1 溶液的制备
2.1.1 内标溶液 精密称取布洛芬对照品40.6 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标贮备液（质量浓度为812 μg/mL）。
2.1.2 对照品溶液 精密称取OA对照品16.4 mg、UA对照品17.2 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（质量浓度分别为328 μg/mL和344 μg/mL）。
2.1.3 供试品溶液 取本品粉末约1 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇80 mL，加热回流2 h，放冷，提取液转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.2 电泳条件
未涂层弹性融硅石英毛细管柱55 cm×75 μm ID，有效长度46 cm；以1.2 mmol/L三乙胺?HCl（pH=10.60），β?环糊精（0.08 mmol/L ）为运行缓冲液；分离电压12.5 kV；重力进样10 s（高度20 cm）；温度25 ℃，湿度小于45%。毛细管柱在使用前依次用去离子水、0.1 mol·L-1的NaOH溶液、去离子水、缓冲液各冲洗5 min；检测电极和缓冲液容器用超声波清洗10 min。进样5次之后需按照上述步骤清洗毛细管。对照品、样品色谱图见图1。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线制备 分别吸取一定量的对照品贮备液、内标溶液，加甲醇稀释成含齐墩果酸质量浓度为4.1、8.2、16.4、32.8、49.2、82.0、114.8 μg/mL，熊果酸质量浓度为4.3、8.6、17.2、34.4、51.6、86.0、120.4 μg/mL与内标溶液质量浓度均为40.6 μg/mL的系列溶液。依次重力进样10 s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标（Y），对照品溶液的质量浓度（ρ）为横坐标进行线性回归，分别得回归方程YOA =0.012ρ-0.032 1（r=0.999 5）；YUA=0.011 9ρ-0.030 9（r=0.999 6）。表明OA质量浓度在4.1～114.8 μg/mL、UA质量浓度在4.3～120.4 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
1.齐墩果酸； 2.熊果酸； 3.布洛芬； 4.水
图1 对照品（A）和样品（B）的毛细管电泳色谱图（略）
Fig.1 HPCE chromatograms of the controls (A) and samples (B）
2.3.2 精密度试验 取质量浓度分别为82.0、86.0 μg/mL的OA与UA对照品溶液，重力进样10 s，连续测定5次，记录峰面积并RSD。结果OA的RSD=2.48%、UA的RSD=3.73%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液（批号1）在0、2、4、8、24 h，分别重力进样10 s，记录峰面积。结果OA的RSD=4.54%、UA的RSD=1.21%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.3.4 重复性试验 取同一批号（批号1）样品6份，按“2.1.3”项下方法提取、测定。结果OA的平均含量为1.01 mg·g-1，RSD=4.10%（n=6）；UA的平均含量为3.73 mg·g-1，RSD=1.61%（n=6）。表明分析方法精密度良好。
2.3.5 加样回收试验 精密称取同一批号（批号1）的夏枯草药材6份，加入相应量的OA和UA对照品，按“2.1.3”项下方法处理并测定，计算回收率。OA的平均回收率为96.7%、RSD=2.48%；UA的平均回收率为98.2%、RSD=3.10%。结果表明方法准确、可靠。结果见表1和表2。
2.4 样品测定 取不同产地的夏枯草，按“2.1.3”项下方法处理后测定，记录峰面积，代入回归方程样品中齐墩果酸和熊果酸的含量，结果见表3。
表1 OA回收率试验结果（略）
Tab.1 Recovery of oleanolic acid (n=6)
表2 UA回收率试验结果（略）
Tab.2 Recovery of ursolic acid (n=6)
表3 夏枯草样品中OA和UA的含量测定结果（略）
Tab.3 Contents of oleanolic acid and ursolic acid in the sample
3 讨论
3.1 缓冲液的选择
实验考察了NaAc?HAc，三乙胺?H3BO3，Tris?H3BO3，NaH2PO4?H3PO4，Tris?Na2HPO4，NaH2PO4? Na2HPO4， 三乙胺?HCl等几种电解质体系，并比较各体系不同浓度和不同配比对分离效果的影响。结果发现，只有在三乙胺?HCl和三乙胺?H3BO3这两个体系中OA和UA可以出峰。将这两个体系进行实验对比，三乙胺?HCl体系基线平稳，峰形较好，检测信号灵敏度高，因此认为三乙胺?HCl体系是比较理想的缓冲液。
3.2 添加剂的选择
由于OA和UA属于构造异构体，空间结构中只有一个甲基的位置不同，在未加任何添加剂的情况下，检测时只有一个峰而无法实现分离。在保持体系不变下，对SDS、熊去氧胆酸、β?环糊精、HP?β?环糊精分别进行考察，发现SDS、熊去氧胆酸无法分离OA和UA，HP?β?环糊精分离效果不佳，β?环糊精可有效分离OA和UA。
随后对β?环糊精浓度进行考察，当浓度低于0.08 mmol/L，对照品分离度达不到1.5；在0.08～0.4 mmol/L时，分离度又逐渐下降，且迁移时间延长；浓度大于0.6 mmol/L时，对照品无法分离，见图2。这是由于随着环糊精浓度的增加，相应增加了包结物的浓度，体系黏度增大，延长出峰时间；且浓度增加影响缓冲液的电渗流，溶液中各组分的电泳淌度也发生变化，从而影响分离度。经过对供试品和对照品的多次实验，选择β?环糊精浓度为0.08 mmol/L。
图2 环糊精浓度对分离度的影响（略）
Fig.2 Effect of β?CD concentration on resolution
3.3 分离电压和进样时间的影响
分离电压决定了电场强度的大小，影响电渗流和待测物质的迁移速度，也是影响分离的重要因素之一。在毛细管内径和长度固定的条件下，一定范围内，组分的迁移时间和分离电压成反比关系，随着分离电压增大，样品的迁移速度加快，分离度和灵敏度也越大。在7～22 kV分离电压下进样分析，结果表明，高的分离电场令电渗流速度加快，出峰时间明显缩短，有利于加快分析速度。但分离电压过高，焦耳热增大，会导致噪音大幅度增加，当分离电压达到18 kV时基线有明显的毛刺，并且可以听到高压放电的声音。选择分离电压为12.5 kV。
进样量同时受进样时间和进样高度的影响。在20 cm高度下比较了进样时间为2.0～20.0 s的分离效果，结果表明，峰高随着进样时间延长而增加，但当进样时间大于14.0 s时，峰高增加幅度下降，区带展宽趋于明显，峰形受到影响；进样时间4.0 s以下时，进样量太少，检测到的峰高较小，不利于检测。优化的进样时间为10.0 s。在相同条件下考察了虹吸进样高度为10.0～30.0 cm的分离检测效果。综合考虑，选择的进样高度为20 cm。
3.4 供试品提取方法的选择
实验比较了甲醇、体积分数为95%的乙醇、乙醚、三氯甲烷4种提取溶剂，乙醚、三氯甲烷提取液的杂质较少，但提取率不高，甲醇与体积分数为95%的乙醇提取率相当，而甲醇提取液色谱图杂质峰少，对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰，基线较平稳。选择甲醇作溶剂后，对比超声、索氏、加热回流3种提取方法，结果发现超声和加热回流提取均不如索氏提取的提取率，用索氏提取2 h的样品基线稳定，提取完全，OA和UA的检测状况良好。
4 结论
在优化的实验条件下，夏枯草药材中的OA和UA可以在6 min之内得到很好的分离，高频电导检测器使用方便，灵敏度较高，实验重现性和精密度都比较理想。由于其自身的特点和优势，随着研究的深入，其应用潜力在毛细管电泳分离中草药成分中会得到更大的发挥。
【】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京：化学出版社，2005：198.
［2］ 白洁，陈翔飞，孙海峰.双波长薄层扫描法测定夏枯草中熊果酸的含量［J］.时珍国医国药，2007，18（5）：1150-1151.
［3］ 邹盛勤，蒋柏泉，陈武.反相高效液相色谱法测定夏枯草中两种三萜酸的含量［J］.时珍国医国药，2007，18（1）：5-6.
［4］ 李晓蒙，廖华卫.夏枯草中熊果酸的含量测定［J］.广东药学院学报，2002，18(3)：34-36.
［5］ 阎花丽，赵陆华，朱丹妮，等.衍生化气相色谱法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.中药杂志，1999，24（12）：744-745.
［6］ 刘海兴，杨更亮，赵敬湘，等.毛细管胶束电动色谱法测定夏枯草中两种有效成分［J］.分析化学，2000，28（10）：1275-1277.
［7］ 谢天尧，郑一宁，莫金垣，等.一种简易型毛细管电泳电导检测装置及其应用［J］.分析测试学报，2000，19（3）：5-7.
