紫杉醇脂质体与注射液家兔体内药动学行为比较
【摘要】 目的 比较紫杉醇脂质体（paclitaxel liposome，L?PAC）和注射液（paclitaxel injection，I?PAC）在家兔体内的药动学行为。方法 12只家兔随机分为两组，分别从耳缘静脉单剂量（12 mg·kg?1）注射L?PAC和I?PAC，采用HPLC法测定各时间点血药浓度，用DAS2.0和SPSS13.0软件处理和分析数据。结果 两种制剂的血药质量浓度?时间曲线均符合二房室模型，主要药动学参数t1/2α分别为（1.206±0.205）、（0.538±0.236）h；t1/2β分别为（33.560±6.685）、（12.187±1.255）h；Vd分别为（0.619±0.084）、（0.809±0.087）L；CL分别为（0.035±0.010）、（0.096±0.010）L·h-1；K10分别为（0.043±0.010）、（0.134±0.020）h-1；K12分别为（0.245±0.038）、（0.777±0.252）h-1；K21分别为（0.321±0.058）、（0.594±0.193）h-1；AUC0→24分别为（321.109±18.462）、（200.024±22.937）mg·h·L-1；AUC0→∞分别为（722.195±170.360）、（272.300±38.568）mg·h·L-1；两种制剂的t1/2α，t1/2β，Vd，CL，K10，K12，K21，AUC0→24及AUC0→∞经统计学分析后，存在极显著或显著差异。结论 L?PAC与I?PAC相比，在家兔体内的药动学行为有显著的不同，脂质体制剂具有长效和缓释的特点，在维持较长的体内循环时间的同时，能够更好地浓集于靶组织，减少药物对其他脏器的毒副作用并增加疗效。
【关键词】 紫杉醇 脂质体 药动学 高效液相色谱法
Pharmacokinetics differences between paclitaxel liposome and injection in rabbits after intravenous injection
Abstract:Objective To compare the pharmacokinetics of paclitaxel liposome and paclitaxel injection in rabbits after intravenous administration. Methods Paclitaxel liposome and paclitaxel injection were intravenously administrated to rabbits at a single dosage of 12 mg·h-1. The concentration?time data of paclitaxel in plasma samples were determined by HPLC?UV, and the pharmacokinetic parameters were calculated and analyzed by DAS2.0 and SPSS12.0 software. Results The concentration?time data of paclitaxel liposome and paclitaxel injection were all fitted to two compartment?model, and the main pharmacokinetic parameters for paclitaxel liposome and paclitaxel injection were respectively as follows: t1/2α were （1.206±0.205）and （0.538±0.236）h；t1/2β were（33.560±6.685）and（12.187±1.255）h；Vd were（0.619±0.084）and（0.809±0.087）L；CL were（0.035±0.010）and（0.096±0.010）L·h-1；K10 were（0.043±0.010）and（0.134±0.020）h-1；K12 were（0.245±0.038）and（0.777±0.252）h-1；K21 were（0.321±0.058）and（0.594±0.193）h-1；AUC0→24 were（321.109 ±18.462）and（200.024±22.937）mg·h·L-1；AUC0→∞ were（722.195±170.360）and（272.300±38.568）mg·h·L-1. There were significantly differences in t1/2α，t1/2β，Vd，CL，K10，K12，K21，AUC0→24 and AUC0→∞ between paclitaxel liposome and paclitaxel injection. Conclusion Paclitaxel liposome has higher efficacy, longer release time, higher target tissue concentration and lower side effect than paclitaxel injection.
Key words: paclitaxel；liposome；pharmacokinetics；HPLC
紫杉醇（paclitaxel）是具有抗癌机制的植物药，可用于对常规化疗药物耐药的转移性卵巢癌和乳腺癌的［1］。由于紫杉醇水溶性极差，因此目前国内外上市的注射剂均以聚氧乙基代蓖麻油（cremophor EL）与无水乙醇作为混合溶媒，溶媒中的成分在体内降解时会刺激机体释放组胺，引发严重的过敏反应，尽管治疗前采取了预防措施，但仍有超过41％的病人发生程度不等的过敏反应；而紫杉醇本身亦有神经和血液等系统毒性（如骨髓抑制、白细胞减少、血小板降低等），常导致临床治疗难以进行。因此，改进现有紫杉醇制剂的剂型，增加其水溶性，避免复合溶媒带来的严重不良反应已迫在眉睫。国内外对紫杉醇新剂型的研究已取得一些具有应用价值的成果，其中以脂质体为载体,将其制成靶向制剂已在国内上市，该制剂在保持了与市售紫杉醇注射液相同的抗肿瘤活性的同时明显降低了药物的毒性，提高了机体耐受性。目前关于紫杉醇脂质体制剂药动学研究的报道尚不多，本实验建立了简便灵敏的紫杉醇血药浓度HPLC检测方法，对紫杉醇脂质体（paclitaxel liposome，L?PAC）和注射液（paclitaxel injection，I?PAC）在家兔体内的药动学进行了比较研究。
1 试验材料
1.1 药品、试剂与仪器
注射用紫杉醇脂质体（批号：070307，南京思科药业有限公司生产）；紫杉醇注射液（批号：0704161，北京四环医药科技股份有限公司）；紫杉醇对照品（药品生物制品检定所，批号：1534?200202）；地西泮对照品（中国药品生物制品检定所，批号：171225?200302）；甲醇（一级色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司）；叔丁基甲醚（色谱纯，TEDIA COMPANY，INC.USA.）；实验用水为灭菌注射用水。
高效液相色谱系统（包括1525二元泵，717自动进样器，2487 紫外检测器，Breeze色谱工作站，美国Waters公司）；QT?1型旋涡混合器（上海琪特分析仪器公司）；FA1604上皿天平（上海天平仪器厂）；Centrifuge 5415D型EPPENDOF离心机（基因有限公司）；电热恒温水浴锅（天津中环实验电炉公司）；CQ超声波清洗机（上海医用分析仪器厂）。
1.2 动物
健康家兔12只，雌雄各半，体质量1.8～2.3 kg，由中山大学实验动物中心提供，动物合格证号粤监证字2005A064。
2 方法与结果
2.1 分组与给药
用两组制剂单周期设计试验。将12只家兔随机分为2组，雌雄各半，一侧耳缘静脉给药，第一组给予L?PAC，第二组给予I?PAC，剂量均为12 mg/kg；给药前12 h开始禁食，自由饮水。
2.2 血样采集及预处理
两组均于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、16、24 h分别在对侧耳缘静脉采血1～2 mL，置肝素抗凝管中，3 000 r/min离心15 min，取血浆。
精密吸取900 μL血浆样品置具塞离心管中，加地西泮（内标）溶液100 μL（浓度为20 mg/L），旋涡混匀后，加叔丁基甲醚3 mL，旋涡振荡5 min，3 000 r/min离心10 min，移取上清液至另一具塞试管，残液再加叔丁基甲醚3 mL同法提取2次，合并3次上清液，35 ℃水浴中以氮气流吹干，残渣用流动相1 mL溶解，涡旋助溶，10 000 r/min离心10 min，取上清液50 μL进样。
2.3 HPLC方法学考察
2.3.1 色谱条件
色谱柱：大连依利特C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：室温；紫外检测波长：227 nm；灵敏度：0.05AUFS；流量：1.0 mL/min；流动相：甲醇?水（体积比65∶35）。
2.3.2 标准曲线制备
用空白家兔血浆分别加紫杉醇对照品溶液，配制浓度为0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mg/L的血浆标样，并均已加地西泮溶液（20 mg/L）100 μL，按上述“2.2”处理血样并进样50 μL，每个浓度作6个样品，测定后其峰面积比值（紫杉醇/地西泮），并求出6次峰面积比值（A），以A平均值对血浆质量浓度（ρ）进行回归分析，回归方程为A＝0.1281ρ－0.0982（r＝0.9997），结果表明紫杉醇在0.1～40.0 mg/L范围内线性关系良好，最低定量限为0.1 mg/L。
2.3.3 专属性考察
紫杉醇与内标以及血浆杂质均分离完全，峰形良好，紫杉醇与内标保留时间分别为14.3 min和10.1 min，色谱图见图1。
A．空白血浆； B.地西泮； C.紫杉醇； D.紫杉醇脂质体血浆样品
图1 紫杉醇和内标地西泮色谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms of paclitaxel and diazepam
2.3.4 精密度和回收率
紫杉醇低、中、高3个浓度（1.0，10.0，40.0 mg/L）的提取回收率见表1。在相同的色谱条件下，进行日内和日间精密度测定，结果见表2。
表1 回收率试验结果（n=5）（略）
Tab.1 Recovery test（n=5）
表2 精密度和相对回收率试验结果（n=5）（略）
Tab.2 Precision and relative recovery rate of docetaxel in plasma
2.4 血药浓度?时间曲线
各时间点血药浓度曲线经DAS2.0软件进行拟合分析，比较拟合优度值和AIC值，紫杉醇脂质体和普通注射液均符合二房室模型，见图2。
图2 家兔单剂量静脉注射紫杉醇注射液和脂质体制剂后的血浆中药物浓度?时间曲线（略）
Fig.2 Plasma concentration?time curves of paclitaxel after a single dose injection in rabbits
2.5 药动学参数
静脉注射两种制剂后的主要药动学参数见表3。
表3 家兔单剂量（12 mg·kg-1）注射紫杉醇注射液和脂质体制剂后的药动学参数(n＝6)（略）
Tab.3 Pharmacokinetic parameters of L?PAC and I?PAC after a single intravenous administration dose of 12 mg·kg-1 to rabbits(n＝6)
**P<0.01，*P<0.05
表3中的参数用SPSS 13.0 for Windows统计软件行t检验统计学分析，结果可见，与I?PAC相比，家兔单剂量静注L?PAC后，其t1/2α,t1/2β, Vd，CL，AUC0→24和AUC0→∞等药动学参数均发生了显著或极显著改变，这提示紫杉醇脂质体改变了紫杉醇的体内药动学特性，药物体内分布容积减少，清除率下降，药物消除半衰期延长，血药浓度?时间曲线下面积显著增大。
3 讨论
3.1 血浆样品中紫杉醇的浓度测定，报道多采用先提取再测定的方法，提取溶剂有的采用无水乙醚［2］、有的采用叔丁基甲醚［3，4］；内标物质有的采用炔诺酮［2］，有的用多西紫杉醇［4］或地西泮［3,5］，流动相多采用甲醇、乙腈及水按不同比例组成［2-4］。本实验经比较提取率、峰型、保留时间、分离度等指标，最终确定以地西泮为内标，用叔丁基甲醚提取3次，以甲醇?水（体积比65∶35）为流动相，方法学研究表明，此法简便可行，结果可靠。
3.2 目前国内报道紫杉醇动物及人体内药动学研究、动物组织分布研究大多采用HPLC?UV法测定，有文献［4］报道由于紫杉醇紫外检测波长较低，影响HPLC?UV法测定灵敏度。本实验在进行家兔体内紫杉醇脂质体药动学研究时，为避免药物代谢后浓度降低及检测灵敏度问题，提高了给药剂量，因此测定结果准确可靠。
3.3 考虑到抗癌药对实验动物各脏器毒副作用较大，且本实验给药剂量亦较大，因此采用随机分组单周期单剂量给药方案，测定家兔静注紫杉醇脂质体和注射液后的血药浓度，并考察了t1/2α，t1/2β，Vd，CL，AUC等主要药动学参数，结果脂质体的Vd和CL均显著低于普通注射剂，表明脂质体中的药物能够更好地浓集于靶组织，减少药物对其他组织的毒副作用；同时脂质体的t1/2β和AUC0→24、AUC0→∞明显长于和大于普通注射剂，这与脂质体缓慢释放药物的性质有关，因而可较长时间地保持血药浓度在特定的窗内，达到长效的作用。总之，与普通注射液相比，紫杉醇脂质体家兔静脉注射给药后，显著改善了紫杉醇原药的药动学性质，具有缓释、长效和靶向的作用。
【文献】
［1］ 李媛，李振宇．天然抗癌药物—紫杉醇［J］．中山大学研究生学刊:、医学版，2006，27（4）：58-62．
［2］ 周卫，吕琦，翁帼英．紫杉醇脂质体在大鼠体内的药动学［J］．药科大学学报，2000，31（6）：443-446．
［3］ 何蕾，王桂玲，张强．紫杉醇纳米乳剂的体内外考察［J］．药学学报，2003，38（3）：227-230．
［4］ 仝新勇，周建平，谭燕，等．紫杉醇纳米脂质体在大鼠体内的药动学［J］．中国药学杂志，2006，26（6）：677-679．
［5］ 阎家麒，王悦，王九一．紫杉醇隐形脂质体的制备及在小鼠体内的组织分布［J］．药学学报，2000，35（9）：706-709．
