藤梨根正丁醇提取物对人食管癌细胞生长作用的实验研究

               作者：张丽， 国宏莉， 田林， 曹书芬， 度长海 

[摘要]  目的:探讨藤梨根正丁醇提取物对培养的人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用。方法:MTT比色法检测藤梨根正丁醇提取物在不同浓度(1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)及不同时间(24 h、48 h、72 h)对Eca-109细胞生长抑制作用， TUNEL法检测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应。结果:①藤梨根正丁醇提取物对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。②提取物对瘤细胞有明显的凋亡效应。结论:藤梨根正丁醇提取物能有效抑制人食管癌Eca-109细胞生长。

　　[关键词]  藤梨根/猕猴桃根；食管肿瘤；抑制；凋亡

　　Abstract:Objective To evaluate the  inhibitory effect of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on human carcinoma of esophagus cells(Eca-109).Methods  MTT colormetric assay was used to examine the growth inhibition of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on Eca-109 cells, TUNEL test was performed to observe the apoptosis induced by the extracts (1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)on Eca-109 cells.  Results  ① The inhibitory effect of the extracts on Eca-109 cells was increased in a dose-and time-dependent manner.  ②The extracts could significantly induce apoptosis of Eca-109 cells. Conclusion The extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol could effectively inhibit Eca-109 cell growth.

　　Key words: Tengligen/actinidia arguta; Esophagus tumor; Inhibitory effect; Apoptosis

　　细胞凋亡是由基因编码控制的一种细胞的程序性死亡，是机体维持正常生理活动所必需的。近年发现细胞凋亡在许多疾病尤其在肿瘤的发生、及转归中起着重要作用，这为肿瘤病人的提供了新的思路。随着中医药对肿瘤治疗的大量临床观察及实验研究的深入,人们逐渐肯定了它对肿瘤治疗方面的疗效。其抗肿瘤作用机制有多方面，如抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）活性等[1-4]。藤梨根又称阳桃根，为植物猕猴桃科藤梨（软枣猕猴桃）Actinidia  arg-uta(Sieb.teZucc.)Planch.或猕猴桃A.chinensis Planch.的根。研究表明，藤梨根对多种肿瘤细胞有生长抑制作用，采用不同方法所得的提取物其抑制作用存在一定的差异[5-6]。本文通过观察藤梨根对培养的人食管癌Eca-109细胞生长的作用，以探讨藤梨根对人食管癌细胞的作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料人食管癌细胞Eca-109细胞株购于上海市中科院细胞库，RPMI-1640培养基购于武汉天源生物技术有限公司，为Gibco公司产品(货号31800-022)；超级新生牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品(批号050126)；实验用1∶250胰酶购于武汉天源生物技术有限公司，为Difco公司产品(批号020411)；四甲基偶氢唑蓝(MTT) 购于武汉天源生物技术有限公司，为Duchefa分装(货号BS0880)；二甲亚砜(DMSO) 购于武汉天源生物技术有限公司，为Sigma公司产品。TUNEL试剂盒(编号ZK-8005) 购于北京中杉生物技术有限公司。

　　1.2  细胞培养细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h换液一次。

　　1.3  药物制备将藤梨根1 kg粉碎成粗粉，烘干备用。取藤梨根500 g，加入3 000 ml正丁醇中浸泡12 h；回流提取1 h，过滤；药渣再加2 000 ml正丁醇回流提取1 h；合并两次滤液，减压回收正丁醇至稠膏状，真空干燥；干燥品加蒸馏水500 ml，旋转加热溶解，制成饱和水溶液；灭菌；原液(500 ml，1 g/ml，pH=3.8)。将原液稀释成1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml三个药物浓度；过滤；灭菌；分装，置4 ℃冰箱备用。

　　1.4  MTT法将贴壁细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔板，待24 h细胞贴壁后加入藤梨根正丁醇提取物药液。实验组分别加入终浓度为1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml 3个药物浓度的药液，对照组加入等体积溶剂的培养液，每组l2复孔，分别于加药后第1、2、3 d测定各孔的吸光度值(A值)。测定前每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，温育4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl /孔。同时振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定A490值。用各组的平均A值细胞生长抑制率。生长抑制率=（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100%。

　　1.5  TUNEL法检测凋亡细胞将浓度为4×104/ml的Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的干净盖玻片上，用RPMI 1640培养基于37 ℃、5%CO2条件下在24孔板中培养24 h后取出盖玻片，PBS冲洗3次。0.1%Triton-100破膜、4%多聚甲醛固定，H2O2阻断。用TDT法将生物素标记的d-UTP在末端转移酶的作用下，标记到DNA的5′端缺口上，再用亲和素标记的HRP与之结合，然后加入底物DAB显色，苏木素复染，从而使凋亡细胞核呈现棕褐色，未凋亡细胞核呈蓝色。在光学显微镜下随机计数5个高倍视野约1 000个细胞中的凋亡细胞数, 计算凋亡细胞所占比例。

　　2  结果

　　2.1  MTT法检测生长抑制率结果表明藤梨根正丁醇提取物对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。用1 μg/ml的正丁醇提取物作用24 h，细胞生长抑制率为18.5%；当延长至72 h时，抑制率上升至45.3%；而100 μg/ml的药物作用72 h时，可使85%以上的细胞生长受到抑制（见表1）。

　　表1  藤梨根正丁醇提取物对Eca-109细胞的生长抑制率（略）

　　2.3  TUNEL法检测细胞凋亡当用1 μg/ml藤梨根正丁醇提取物处理Eca-109细胞24 h时，可检测到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞；当药物作用时间延长至72 h时，可见凋亡细胞变圆，体积明显缩小，核染色质浓缩，变成新月形，此为晚期凋亡细胞，随时间的推移，凋亡细胞比例逐渐增加（见图1）。而对照组，未见有明显凋亡现象（见图2）。

　　3  讨论

　　肿瘤是危及人类生命的首要顽疾，药物为中西医肿瘤治疗中的一个重要模式，包括化学药物和天然药物。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定，其机制有多方面，如抑制DNA合成、抑制肿瘤血管形成、诱导细胞分化、促进细胞凋亡、调节机体免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）活性等[1-4]。关于藤梨根的研究已有报道，其对消化系统肿瘤有良好的抗肿瘤作用，可用于消化系统肿瘤的治疗[5]，但其抗肿瘤作用机制还不清楚。初步研究发现，同种猕猴桃根不同提取方法所得的提取物其抗肿瘤作用可能不尽相同。有学者用甲醇、水、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂回流提取, 观察提取物对同种肝癌细胞株的作用, 结果表明正丁醇、乙酸乙酯提取物对瘤细胞的生长有较好的抑制作用, 但各组量效关系不明显[6]。关于藤梨根提取物中抗肿瘤作用的成分, 曾有人报道主要为三萜类化合物, 分别为乙酸乙酯提取物熊果酸、β-谷甾醇及正丁醇提取物2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、2β,3β,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、24-hydroxytormentric acid[7]。研究表明，藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑制作用。钟振国[8]等采用MTT比色法、集落形成法等方法对藤梨根作用的宫颈癌细胞株Hela、神经肿瘤细胞株NG108-15、胃癌细胞株SGC7901等进行了研究，结果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不同程度的抑制作用。李昊[9]等研究了藤梨根对人胃低分化腺癌BGC-823细胞的作用，发现其浓度在1.3 mg/ml时抑瘤率最强(88.19%)，随着药物浓度的降低，抑瘤率随之下降；藤梨根对胃癌细胞作用24 h抑制作用最强(87.6l%)，48 h回落，72 h再次上升, 其对胃癌细胞有明显杀伤作用。卫培峰[10]等在动物实验中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌细胞的凋亡, 与对照组细胞的凋亡率和死亡率有显著的差异。 近几年来，国内外对细胞间隙连接通讯与癌变的关系进行了大量的研究，发现多数肿瘤细胞无此功能，其间隙连接少或无，而邻近的正常组织或良性肿瘤的间隙连接正常，少数肿瘤细胞有脆弱的连接通讯，但很容易受到破坏，其间隙连接数量很少，藤梨根可以通过上调细胞间隙连接通讯功能来抑制某些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生长[11]。本研究结果证实：藤梨根正丁醇提取物三个药物浓度1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml作用于Eca-109细胞24 h、48 h、72 h后，显示出明显的凋亡特征。TUNEL法可检测到不同时期的凋亡细胞；MTT法也发现随药物浓度升高和作用时间的延长,其抑制率明显升高。因此推测，诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一。但细胞凋亡的调控及信号传导极其复杂，有多种分子参与。故抗肿瘤作用的真正机理及体内抑瘤实验尚需进一步深入研究。

　　(文中图1~2见封四)（略）

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