木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建

                    作者：王丹　何浪　王玉明　潘克俭　李维 

【摘要】  　　目的 克隆木薯醇腈酶（HNL）cDNA构建表达载体，以实现木薯醇腈酶基因的高效表达。方法 运用 RT-PCR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长cDNA序列，将其克隆至质粒pBluescript SK中进行序列分析，再利用PCR将其再克隆到酵母表达质粒pPIC3.5K上。结果 经测序分析表明，克隆的cDNA片段和报道的4个木薯HNL cDNA 相比，核苷酸同源性最高为99.1%，氨基酸同源性最高为98.8%。结论 经双酶切鉴定的结果表明重组表达载体的表达载体构建成功。

【关键词】  木薯；醇腈酶；甲醇酵母；表达载体

　    Abstract：Objective To study the cloning of the cDNA of α-HNL and the expression vector construction to realize highly efficient expression in NL gene.Methods The long-length sequence of cDNA of α-HNL was amplified by RT-PCR,then it was cloned into pBluescript SK and analylizd in its sequence.Finall,the cDNA was cloned into an expression vector pPIC3.5K by PCR.Results The sequencing result of the cDNA showed that the sequence encoded for the HNL was not fully consistent with those published.The full sequences analysis demonstrated that the highest homology of cDNA sequence is about 99.1% and the highest homology of amino acid sequence is about 98.8% to those four reported HNL genes from cassava.Conculsion Degestion detection of pPIC3.5K-HNL showed that construction of recombination expression vector was successful.

    Key words:cavassa；Hydroxynitrile lyase；Pichia pastoris；expression vector

      手性化合物中不同立体异构体具有不同的生理活性，许多医用药品要求必须是单一性化合物，不仅药效可提高，更为重要的是副作用小。因此，研究和开发手性药物具有广泛的市场需求。醇腈酶（α-Hydroxynitrilelyase, E.C.4.1.2.10，HNL）作为一种生物催化剂，能可逆的催化由HCN和醛或酮生成手性氰醇［1，2］，从而克服了由于光学拆分而造成的成本较高的缺点。以生产扁桃腈为例，传统方法是以苯甲醛为原料，与无水HCN反应后得到dl-扁桃腈，再进行光学拆分成为单一化学物，而采用HNL作为该反应的催化剂，直接催化HCN添加到醛或酮上，形成相应的具有光学活性的氰醇，从而实现扁桃腈的不对称合成，大大降低了生产成本，反应生成的光学活性氰醇还可转化成羟基化合物、胺化合物、羧基化合物等多种重要的手性中间体［3］ ，后者可进一步转化成多种手性药物。

    现已证实3 000多种植物体内含有HNL。相关研究主要集中在木薯、三叶胶以及蔷薇科的几种植物中［4］，来自蔷薇科植物的HNL可催化R-型氰醇化合物的合成；木薯、三叶胶中的HNL则立体专一性催化脂肪族、芳香族和杂环族Ｓ型羟腈化合物的合成［5］。从界中直接获取Ｓ型醇腈酶不仅得率低，且纯化较难。因此，采用基因工程技术获得大量HNL以满足工业生产的需求，具有十分重要的意义，并有助于HNL的基础研究。通过RT-PCR方法从木薯幼叶组织的总RNA中扩增出一种HNL基因的cDNA序列。序列分析表明，与DNA数据库公布的已有木薯HNL编码序列不完全一致。将其克隆至表达质粒pPIC3.5K中，构建重组表达载体，为下一步在甲醇酵母中实现高效表达，深入研究其作用机理以及开展工业生产奠定了基础。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  植物材料  木薯采自海南琼海，取当天采集的新鲜木薯的幼嫩叶子提取RNA。

    1.1.2  菌种和质粒  表达质粒pPIC3.5K购自Invitrogen公司；大肠杆菌(E.coli JM109),质粒Bluescript SK(pBS)由本实验室保存。

    1.1.3  酶和试剂  RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、DNA连接试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；抗生素G418购自Sigima公司；限制酶、Taq DNA聚合酶，其它抗生素等分别购自华美生物工程公司、Promega等公司；其他化学试剂均为国产分析纯或进口分析纯。

    1.1.4  培养基  LB，LA，SOB，SOC培养基均按Invitrogen公司操作手册推荐方法配制。

    1.2  方法

    1.2.1  基因操作  质粒DNA的制备、限制酶切、连接反应、细菌转化、凝胶电泳、DNA片段的回收等，参照文献［6］或按供应商提供的相关说明操作。

    1.2.2  木薯幼叶组织总RNA的提取  取木薯新鲜幼叶，用液氮研磨3～4次，用RNA提取试剂盒提取总RNA。

    1.2.3  RT-PCR扩增HNLcDNA  根据Haughes［7］等报道的木薯醇腈酶cDNA序列设计RT-PCR引物，由上海基康生物有限公司合成。其中上游引物设计EcoRⅠ酶切位点，下游引物引入BamHⅠ酶切位点，具体序列如下:

    上游引物Hnl-1：5′-cggaattcatggtaactg?

    cacattttg-3′

    下游引物Hnl-2：5′-gtggatcctcaagcatat?

    gcatcagcc-3′

    RT-PCR则参照试剂盒说明书按以下方法进行：50℃ 30min合成cDNA第一链后，直接加入试剂盒提供的专一性Taq DNA polymerase进行PCR反应，PCR参数为：94℃预变性3min后，按94℃变性1min，57℃复性1min，72℃延伸1min,进行30个循环，然后于72℃再延伸10min。

    1.2.4  DNA序列的测定  用ABI377全自动测序仪测序。

    1.2.5  表达载体的构建  用质粒提取试剂盒分别提取约20μg重组质粒和表达质粒pPIC3.5K，分别经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，并用连接酶连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板，培养过夜。

    2  结果

    2.1  木薯HNLcDNA的克隆及序列测定

    从木薯幼叶组织提取总RNA为模板(图1)，按材料和方法中所述条件进行反转录，再进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，检测到一条约0.8 kb的DNA片段，正好与预期的扩增片段相符（图2）。

    Lane3:18S RNA and 28S RNA RNA of cassava leave

    图1  木薯幼叶组织总RNA的电泳

    Fig.1  Electrophoresis analysis of RNA of cassava leave

    RT-PCR产物经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，和经同样酶切处理的pBS 连接，转入E.coli JM109，筛选重组质粒，通过酶切鉴定(图2)，获得阳性克隆，命名为pBS-HNL。对插入的片段进行DNA序列测定(图3)。该cDNA序列实际长度为777个碱基，编码258个氨基酸，与来自木薯的醇腈酶Me-HNL10基因的cDNA序列相比［7］，123，252，373，435，628，660，683位的碱基T，C，C，C，G，A，C分别被C，G，T，A，A，T，T所代替，导致125，210位的氨基酸leu,val变为phe，Ile；与程树华等报道的醇腈酶clonhnl cDNA序列［8］比较：337，373，435，476，628，634，636，660，683位的碱基A，C，C，T，G，T，A，A，C分别被G，T，A，A，A，C，T，T，T所代替，导致113，125，158，210位的氨基酸：Ser，leu，phe，val变为Gly，phe，Tyr,Ile。

    Lane 1:λDNA/HindIII marker;Lane 2:RT-PCR product

    Lane 3:pBS/EcoRI;Lane 4:pBS-HNL/EcoRI＋BamHI

    图2  电泳分析RT-PCR产物及限制酶切分析阳性克隆

    Fig.1  Electrophoresis analysis of product by RT-PCR and analysis of positive cloning by restrictive enzyme technique

    2.2  表达载体的构建

    为了在甲醇酵母中表达木薯HNL，根据质粒pPIC3.5K限制酶分布位点的特点，设计如下引物：

    上游引物Hnl-3  5′-gcggatccatggtaactg?

    cac-3′

    下游引物Hnl-4  5′-gcgaattcaagcatatgc?

    atc-3′

    其中上游引物引入BamHⅠ酶切位点，下游引物加上EcoRⅠ位点，以质粒pBS-HNL为模板进行PCR扩增，得到两端分别含有BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点的HNL片段，将其双酶切后与经同样处理的pPIC3.5K连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含有氨苄的LB平板，培养过夜，待长出单菌落后，挑取单菌落于液体LA中，培养16h，提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳，选取增大的质粒DNA，为可能的重组子。用限制性酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定，酶切产生了0.8Kb的片断，与预期相符（图4）。证明为所需的重组子，命名

    1道:经HindⅢ酶切的λDNA标准;2道:无;

    3道:pPIC3.5K-HNL/BamHⅠ+EcoRⅠ;4道:pPIC3.5K-HNL/BamHⅠ

    图4  酶切鉴定重组子pPIC3.5K-HNL

    Fig.4  Regestion detection of pPIC3.5K-HNL

    为pPIC3.5K-HNL，其构建流程见图5。

    图5  重组质粒pPIC3.5K-HNL的构建流程

    Fig.5  The course of Construction of recombinant plasmid pPIC3.5K-HNL3  讨论

    已有的研究结果表明，木薯基因组中含有多个HNL基因成员，已确定序列的有至少3个成员，包括mehnl10,mehnl14,mehnl24以及clonhnl（可能为新成员）。将本研究获得的醇腈酶cDNA与已报道的，同源性较高的序列进行了序列比较，结果显示与Me-HNL10 cDNA序列的同源性为99.1%，氨基酸序列同源性为98.8%，与colnhnl cDNA序列的同源性为98.8%，氨基酸序列同源性为98.1%。但根据同源性比较结果，我们还不能确定本研究中克隆的HNL属于其中的哪一类成员。

    甲醇酵母（pichia pastoris）表达系统是一种较好的外源基因表达系统，它的蛋白质加工方式和高图3  克隆的木薯HNLcDNA序列及推测的氨基酸序列

    Fig.3  Nucleotide and deduced amino acid sequences of α-hydroxynitrile lyase cDNA from cassava阴影部分表示:克隆到的木薯HNLcDNA序列与Me-HNL10 cDNA相比,碱基对不同的部分;黑体部分表示：与colnhnlcDNA相比,碱基对不同的部分.方框部分表示:根据克隆的木薯HNLcDNA序列所推测的其氨基酸序列与Me-HNL10相比不同的部分;下划线表示:与colnhnl相比不同的部分。

    Shadow:the different part of base pairs Compared to Me-HNL10 cDNA;Black:the different part of base pairs compared to colnhnl cDNA;Pane :the different part of deduced amino acid sequences compared to Me-HNL10;Underline:the different part of deduced amino acid sequences compared to colnhnl.等真核生物相似，为理想的高等真核蛋白表达系统［9］。目前国外从多种植物中克隆了HNL基因,其中Hasslacher等将来自三叶胶的HNL cDNA分别在大肠杆菌、酿酒酵母和甲醇酵母中实现了表达，研究结果表明三叶胶HNL cDNA在甲醇酵母中表达量最高，目的产物可达可溶性总蛋白的30%［10］；而Haughes等在大肠杆菌中表达了来自木薯的hnl基因［11］。国内也有研究报道在大肠杆菌中表达木薯HNL基因，酶活力为2100U/L发酵液［8］，但无在甲醇酵母中表达的报道。为了进一步提高木薯HNL的表达量，本项研究将木薯HNL插入到甲醇酵母pPIC3.5K中，成功构建甲醇酵母表达载体，下一步将构建工程菌，完善发酵条件，以实现木薯HNL的高效表达。

【】
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