高效液相色谱法测定武打将军酒中大黄素的含量

【摘要】  目的建立制剂武打将军酒中大黄素的含量测定方法，为控制武打将军酒的生产质量提供理论依据。方法采用高效液相色谱（HPLC）法，色谱柱为Lichrospher C18柱，流动相为甲醇∶0.1%磷酸（75∶25），检测波长254 nm，流速1.00 ml·min-1。结果大黄素得到完全分离。线性范围为0.130 6～1.306 0 μg，加样回收率为99.8%，RSD为0.82%。结论 该法简便快速，精密度和稳定性良好，能有效控制武打将军酒的质量。

【关键词】  高效液相色谱法； 武打将军酒； 大黄素

　　武打将军酒是由虎杖等多味药材组成的复方制剂，具有活血祛淤、消肿止痛等功效，临床上用于跌打损伤、风湿骨痛，类风湿关节痛等症，是广西壮医医院优良的专科制剂品种。虎杖为该制剂的君药之一。研究表明其主要成分为大黄素、大黄素甲醚和大黄酚［1］等。为有效控制该制剂的质量，本实验有关［2～4］，采用高效液相色谱法测定武打将军酒中大黄素的含量。现报道如下。

　　1  仪器与试药
   
　　Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷仑）；VWD紫外检测器；大黄素对照品（药品生物制品检定所，批号110756-200110）；武打将军酒（广西壮医医院制剂室提供，批号：050124，050212，050415，050606，050711）；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件色谱柱为Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇：0.1%磷酸（75∶25）；检测波长254 nm；流速1.00 ml·min-1；柱温为室温；进样量10 μl。

　　2.2  对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品适量，置150 ml量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液 （浓度为0.130 6 mg/ml）。

　　2.3  供试品溶液的制备精密量取武打将军酒2 ml，置蒸发皿中，加硅胶（柱层析用，100～200目，下同）1 g，置温水浴上蒸干，移至硅胶柱（内径17 mm，硅胶15 g，干法上柱）上，用石油醚（60～90℃）?醋酸乙酯?甲酸（100∶100∶2）混合溶液90 ml 分次减压洗脱，收集洗脱液，置100 ml量瓶中，并用混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.4  阴性对照品溶液的制备按处方比例及工艺配制无虎杖的阴性对照品100 ml，精密量取2 ml，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，制成阴性对照溶液。
   
　　分别精密量取大黄素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入色谱仪，按上述色谱条件进行测定，结果在254 nm波长下供试品中大黄素色谱峰与其他组分分离良好，与对照品大黄素的保留时间一致，阴性对照溶液在大黄素色谱峰出峰的时间，没有任何杂质峰干扰。色谱图见图1。

　　2.5  标准曲线的制备精密量取大黄素对照品溶液（浓度为0.130 6 mg/ml）1，2，4，6，8，10 ml，分别置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密量取10 μl注入液相色谱仪，测定其峰面积值，以进样量（C）为横坐标、峰面积值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归方程：A=39.561 0C-16.645 1,r=0.999 9。结果表明大黄素在0.130 6～1.306 0 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

　　图1  武打将军酒HPLC图（略）

　　2.6  精密度实验精密量取同一对照品溶液（65.3 μg/ml），依法连续进样6次，10 μl/次，测定大黄素峰面积，结果大黄素峰面积值的RSD为0.45%。

　　2.7  稳定性实验取供试品溶液（批号050124），分别于0，2，4，6，12 h进样1次。依法测定大黄素峰面积，结果大黄素峰面积值的RSD为0.98%，表明供试液在12 h内稳定。

　　2.8  重复性实验取同批样品（批号050124）6份，精密量取，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，按上述色谱条件测定大黄素峰面积，结果大黄素峰面积值的RSD为1.04%。

　　2.9  加样回收实验精密量取已知大黄素含量的样品溶液（批号：050124，大黄素含量为 2.238 9 mg/ml）6份，置蒸发皿中，分别加入大黄素对照品溶液（浓度为0.130 6 mg/ml），按“供试品溶液的制备”项下方法操作，精密吸取10 μl进样测定，回收率和RSD，结果见表1。

　　2.10  样品含量测定取样品5批，照供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别精密吸取10 μl进样测定。结果见表2。

　　3  讨论
   
　　大黄素的含量测定方法，记录有比色法、分光光度法、薄层扫描法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等［2～4］。本实验采用高效液相色谱法，分离效果好，专属性强，灵敏准确。

　　表1  大黄素加样回收率实验结果（略）

　　表2  样品含量测定结果（略）

　　本制剂处方药味众多，干扰组分多。本文曾比较过酸水解氯仿提取法和柱层析提取法提取样品中的大黄素，结果表明柱层析提取法测得含量结果较酸水解氯仿提取法高，且杂质峰较酸水解氯仿提取法少，故选用柱层析提取法，该法既简便省时又准确。
   
　　曾采用甲醇、磷酸以不同比例进行实验，摸索本实验液相色谱的最佳测定条件。实验结果表明，选用甲醇∶0.1磷酸（75∶25）大黄素出峰时间适宜，与其它共存成分分离较好。
   
　　【文献】
  　　［1］ 江苏新医学院.中药大辞典，上册［M］.上海：上海人民出版社，1986：1329.

　　［2］ 中华人民共和国药典委员会.药典，Ⅰ部［S］.北京：化学出版社，2000：167，562.

　　［3］ 梁广华，张建浩.虎杖药材中蒽醌衍生物及其苷类成分的测定［J］.中药材，2005，28（9）：784.

　　［4］ 赵春香，刘震凌，王丽娜，等.HPLC法测定颈痛灵药酒中大黄素的含量［J］.中国药品标准，2003，4（5）：46.