复元胶囊对实验性骨关节软骨细胞凋亡及Bax和Bcl-2mRNA表达的影响

　　3 结果

　　3.1 透射电镜下观察软骨细胞超微结构正常软骨细胞核完整，核膜清晰，核内染色体均匀分布，粗面内质网呈层状排列，线粒体散在分布、细胞表面有许多微绒毛突起。见图1A。凋亡细胞体积明显缩小，突起消失，细胞从周围软骨基质退缩，核膜发生皱褶，染色体浓集，胞质密度增高，有典型的凋亡小体，内有细胞器，细胞周围可见脱落的凋亡小体。见图1B。

　　3.2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况凋亡的软骨细胞核呈棕黄色，主要分布在软骨的浅层和中层。正常组阳性细胞表达最低;复元胶囊组和壮骨关节丸组凋亡指数明显低于模型组，复元胶囊组和壮骨关节丸组比较，复元胶囊组低于壮骨关节丸组。见图2和表2。图1 软骨细胞超微结构(透射电镜，600×)正常组 模型组壮骨关节丸组 复元胶囊组图2 TUNEL法检测各组凋亡软骨细胞(光镜，400×)

　　3.3 软骨细胞Bax和Bcl-2mRNA的表达各组软骨提取的RNA经逆转录并扩增后，电泳显示不同的荧光强度(见图3)。图象分析结果(见表3)显示，模型组Bax mRNA表达均显著增加，与正常组、壮骨关节丸组和复元胶囊组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01);模型组Bcl-2mRNA的表达低于复元胶囊组(P<0.05)，复元胶囊组Bax的表达比壮骨关节丸组弱，而Bcl-2mRNA的表达比壮骨关节丸强，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组Bax/Bcl-2比值明显高于正常组、壮骨关节丸组和复元胶囊组(P<0.01)。表2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡指数比较图3 各组软骨细胞Bax和Bcl-2mRNA的表达表3 各组软骨细胞Bax和Bcl-2mRNA的表达及Bax/Bcl-2比值

　　4 讨论

　　OA在祖国医学属于“痹证”“骨痹”范畴，肾元亏虚、肝血不足、气虚血淤是导致本病的根本内因。复元胶囊具有补益肝肾，益气活血之功效，我们前期研究发现，复元胶囊可促进软骨细胞的增殖、DNA及胶原合成，从而对OA软骨退变有一定防治作用[4]。本研究从OA软骨细胞凋亡的角度研究复元胶囊的作用，探讨其治疗OA的作用机理。

　　细胞凋亡(apoptosis)是一种由基因控制的、主动地去除非需要或损伤细胞的程序性死亡过程，然而，过度凋亡则是病理性的和有害的。本实验结果显示，透射电镜下可观察到典型的凋亡形态，包括细胞体积缩小、染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等;细胞凋亡末端原位检测(TUNEL)发现，经Hulth法建立的OA动物模型关节软骨有凋亡细胞阳性表达，主要位于浅层和中层，再次证明软骨细胞凋亡参与了OA的病理改变。

　　细胞的凋亡与细胞的增殖、生长、分化一样，是细胞生长发育的一种过程，这个过程被多种基因所调控。Bax和Bcl-2是一对正负调节因子， Bax/Bcl-2的比值与决定细胞接受刺激信号后存活与否有关， Bax/Bcl-2比值降低，则抑制细胞凋亡，反之，则促进细胞凋亡。许多研究已证实，在细胞凋亡异常的疾病中，存在着Bax/Bcl-2比例的异常，即促凋亡因子Bax和凋亡抑制因子Bcl-2两者失衡[5]。

　　本研究发现，模型组细胞凋亡指数的增加伴随Bax表达的增加，说明Bax是促使关节软骨凋亡的重要因素之一。同时，软骨细胞凋亡指数的升高也伴随Bcl-2表达的增加，可能反应了机体对凋亡的一种调控，通过上调细胞凋亡抑制因子，保护软骨细胞免受凋亡，这可能是OA病理过程进展缓慢的一个重要原因[6]。而且，造模后的软骨细胞凋亡指数的增加与Bax/Bcl-2比值明显升高相关。

　　现代药理学研究发现，组成复元胶囊的药物中，鹿茸的有效成分鹿茸多肽、川芎的有效成分川芎嗪能抑制软骨细胞过度凋亡[7，8]，人参、淫羊藿、黄芪、枸杞子有抗氧化、延缓衰老的作用。本研究表明，复元胶囊通过降低促凋亡因子Bax表达，增加凋亡抑制因子Bcl-2的表达，并调节Bax/ Bcl-2的比值减少骨关节炎软骨细胞过度凋亡，从而延缓骨关节炎软骨退行性改变过程。

【参考文献】
  　[1] Kim DY，Taylor HW，Moore RM.Articular chondrocyte apoptosis in equine osteoarthritis[J].Vet J，2003，166(1)：52.

　　[2] Kimura T. Progress of Research for Osteoarthritis. An overview of the recent knowledge on osteoarthritis: pathogenesis， evaluation and therapies[J].Clin Calcium，2009，19(11):1565.

　　[3] Hulth A， Lindberg L， Telhag H.Experimental osteoarthritis in rabbits. P reliminary report[J].Acta Orthop Scand，1970，41(5):522.

　　[4] 胡文兴， 周小莉， 李荣亨.复元胶囊含药血清对软骨细胞增殖与合成代谢的影响[J].中国中医基础医学杂志，2008， 4:32.

　　[5] Wang SJ， Guo X， Zuo H， et al.Chondrocyte apoptosis and expression of Bcl-2， Bax， Fas， and iNOS in articular cartilage in patients with Kashin-Beck disease[J]. J Rheumatol， 2006 ，33(3):615.

　　[6] 李 志，郭志强，张晓刚.兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡调控基因的研究[J].中国中医骨伤科杂志，2006，5(14):3.

　　[7] 林建华，修忠标，吴朝阳，等.鹿茸多肽对软骨表型化骨髓间充质干细胞凋亡的影响[J].中国修复重建外科杂志，2006，20(4):437.

　　[8] 肖 晟， 李康华， 吕红斌，等.川芎嗪对家兔软骨细胞Bcl-2蛋白表达及凋亡的影响[J].湖南医科大学学报，2003，28(3):224.