新疆紫草止血作用研究

      作者：努尔艾买提江·阿布来提，买尔旦·马合木提，古丽仙·胡加 ，古孜力努尔·依马木

【摘要】  目的研究新疆紫草的止血作用。方法分别给小鼠连续灌胃给予新疆紫草正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇和水提取物7 d，采用断尾法考察对小鼠出血时间的影响，确定有效部位。在此基础上，用新疆紫草醋酸乙酯提取物分别给小鼠和大鼠连续灌胃给药14 d， 测定小鼠凝血时间(CT) 、出血时间(BT)和血小板计数，大鼠活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT) 、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)含量的改变。结果新疆紫草醋酸乙酯提取物能显著缩短CT、 BT、升高血小板数量、缩短凝血酶时间(TT)、提高纤维蛋白原含量(FIB)。结论新疆紫草醋酸乙酯提取物具有较好的止血作用，其机理可能与增加纤维蛋白原含量，促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程，升高小鼠血小板数量，影响抗凝和纤溶系统有关。

【关键词】  新疆紫草; 止血作用; 凝血时间 ; 凝血酶时间; 纤维蛋白原; 血小板

　中药紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma Johnst.，紫草Lithospermun erythrorhizon Sieb.et Zucc.或内蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。具有凉血、活血、解毒透疹等功效[1]。在中医和维吾尔医均用于治疗许多难治性疾病如肿瘤、艾滋病、过敏性紫癜、银屑病等。紫草含有多种生物活性成分。现代药理学研究发现这些成分具有抗肿瘤、抗菌消炎、保肝、抗病毒及真菌、抗生育、降血糖、抗免疫缺陷、抗凝血、止血、抗前列腺素生物合成及抗脂质过氧化等作用[2]。杨荣等[3]研究了软紫草Arnebia euchroma Johnst.，黄花软紫草A.guttata Bge.，紫草Lithospermun erythrorhizon Sieb.et Zucc.)，滇紫草Onosma paniculatum Bur.et Franch.，露蕊滇紫草O.excertum Hemsl.和密花滇紫草O.Confertum w.w.Simth.水提物和醇提物对小鼠断尾出血的作用，发现这6种紫草的水提液和醇提液均有不同程度的止血作用。其中软紫草的水提液和黄花软紫草的醇提液作用较好。新疆紫草在新疆分布广泛，品质最佳。在以往的研究中，课题组研究了新疆紫草的提取物的保肝作用[4～7]。为进一步深入研究新疆紫草的止血作用和有效部位，我们初步考察了新疆紫草的正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇和水提取物对小鼠出血时间的影响，发现这些提取物均可缩短断尾小鼠出血时间，其中醋酸乙酯提取物的作用优于其它提取物。因此，本文报道了新疆紫草醋酸乙酯提取物对小鼠出血时间(BT)、凝血时间(CT)、小板计数以及大鼠血液凝集参数的影响，为进一步开发利用新疆紫草奠定基础。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药材与试剂新疆紫草(新疆参茸药业有限责任公司，批号07112701，由新疆医科大学药学院生药学教研室进行品种鉴定);云南白药(云南白药集团股份有限公司， 批号 20081208);戊巴比妥钠(化学纯，北京通县育才精细化工厂，批号950427);正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇等均为分析纯，醋酸泼尼松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号 080977)。水为纯净水。APTT、 TT、PT、FIB试剂盒 Dianstatica Stago。

　　1.2 动物昆明种小鼠,体质量18～22 g , Wistar大鼠，体质量180～220 g，雌雄各半，由新疆医科大学实验动物中心提供(许可证号SYXK-新2003-0001)。自由摄食进水，饲料由实验动物中心提供，室温18～25℃饲养。

　　1.3 仪器 SYSMEX CA-7000全自动血凝仪(日本);DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);BS224s 电子分析天平( Sartorins公司);旋转蒸发器RE-52(上海亚荣生化仪器厂); SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵(郑州长城科教仪器有限公司)，内径1 mm 的毛细玻璃管、灌胃管、注射器、血细胞计数板、显微镜。手术刀，眼科弯镊，秒表，载玻片，滤纸等。

　　2 方法

　　2.1 供试品的制备称取紫草粉末(过40目筛)500g，分别用正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇、水，于70，77，80，95～100℃下回流提取3次(2，2，1 h)，料液比为1∶5，合并回流液，过滤，经减压回收溶剂浓缩成浸膏，分别得提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，备用。临用前用0.5 % 羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液备用，药物量以按原药材计算。

　　2.2 止血有效部位的筛选 采用断尾法考察以上4个提取物对小鼠出血时间的影响。取小鼠50 只，随机分为空白(0.5%CMC-Na)对照组;给药组：高剂量(20 g· kg-1) 、中剂量(10 g· kg-1) 和低剂量(5 g· kg-1);阳性对照组：云南白药(0.8 g· kg-1)，每组10 只。各组每日分别灌胃给药Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ1次,连续7 d。末次给药后60 min ,将小鼠固定,露鼠尾于外,用手术刀片于小鼠尾尖1/ 2 处横断(严格控制切割深度),待血液自行溢出开始计时每隔30s用滤纸吸去血滴1次,直至血流自然停止(滤纸吸时无血) 为止,即为出血时间。记录小鼠出血时间(BT)。计算出血时间的缩短率。结果以SPSS12.0 统计软件，进行t检验。见表1～4。BT缩短率(%)=空白对照组BT-给药组BT空白对照组BT×100%表1 新疆紫草正己烷提取物的止血时间表2 新疆紫草醋酸乙酯提取物的止血时间表3 新疆紫草乙醇提取物的止血时间表4 新疆紫草水提取物的止血时间由表1～4中数据可看出，与空白对照组相比，所有提取物均可不同程度缩短小鼠的止血时间，其中醋酸乙酯提取物出血时间的差异有统计学意义(P<0.05)。据此，确定醋酸乙酯部位为止血有效部位。

　　2.3 醋酸乙酯提取物对出凝血相关指标的影响

　　2.3.1 对小鼠凝血时间的影响[8]

　　毛细管法：取小鼠50 只,随机分为空白(0.5%CMC-Na)对照组,给药组：高剂量(20 g· kg-1) 、中剂量(10 g· kg-1) 和低剂量(5 g· kg-1);阳性对照组：云南白药(0.8 g· kg-1)，每组10 只。各组每日灌胃给药1次,连续14 d。末次给药后60 min ,参照毛细管法,用内径为1 mm 的毛细玻管插入小鼠内眦球后静脉丛,深约4～5 mm ,轻轻转动再缩回,自血液流入玻管内开始计时,达5 cm 血柱后取出毛细管平放于桌上。每隔30 s 折断毛细管0.5 cm ,观察折断处有无血凝丝出现,记录从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间,此即为凝血时间。玻片法：分组及给药方法同上，末次给药后60 min，用眼科镊迅速摘去一侧眼球,于载玻片两端各滴1滴血,血滴直径约6mm ,立即用秒表计时,每隔30 s 用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动1 次,并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止,所历时间即为凝血时间,另一滴血供复验。

　　2.3.2 对小鼠出血时间的影响取小鼠50 只，分组、给药及操作方法上。末次给药后60 min ,将小鼠固定,露鼠尾于外,用手术刀片于小鼠尾尖1/ 2 处横断(严格控制切割深度),待血液自行溢出开始计时每隔30s用滤纸吸去血滴一次,直至血流自然停止(滤纸吸时无血) 为止,即为出血时间。记录小鼠出血时间(BT)。

　　2.3.3 对小鼠血小板计数的影响取小鼠50只, 随机分为空白(CMC-Na)对照组, 给药组：高，中，低剂量组;阳性对照组(醋酸波尼松片按0.011g· kg-1剂量),每组10 只。给药方法同上, 末次给药后60min ,摘除小鼠右侧眼球取血,用微吸管吸血20μl于1 %草酸铵溶液0.38 ml内,充分摇匀,吸一小滴置于血细胞计数板, 静止10～15min 后,于高倍光学显微镜下计数各鼠血小板数量。

　　2.3.4 对大鼠血液凝集参数的影响 取Wistar大鼠50只，随机分成5组。分别为空白对照组;给药组：高剂量(14g·kg-1)、中剂量(7·kg-1g)和低剂量(3.5g·kg-1);阳性对照组(云南白药：0.9g·kg-1)，每组10只，灌胃给药1次/d，灌胃体积2ml/只，连续给药14天。实验第14天，每组大鼠相隔40 min给药，给药后1 h依次腹腔注射3%戊巴比妥钠生理盐水溶液0.6 ml麻醉，固定，迅速剥离腹主动脉，一次性注射器采血，立即注入于一次性真空采血管(含0.3ml，0.109 mol/L的枸椽酸钠抗凝剂)中，轻轻颠倒摇匀后，立即于3 000 r/min离心10 min。取血清400μl，用凝固法按试剂盒说明测定PT(凝血酶原时间)、APTT(活化部分凝血活酶时间)、TT(凝血酶时间)、FIB(纤维蛋白原含量)。