葛根素对大鼠局灶性缺血脑组织内海马神经元型一氧化氮合酶表达的影响
2结果
2.1脑梗死体积的比较干预组和对照组正常组织被染成红色，梗死灶呈苍白色，从而确定脑梗死范围并得到其梗死体积;假手术组脑组织被染成红色，无苍白色的梗死灶。2h干预组和12h干预组脑梗死体积明显小于对照组(P<0.05)，24h干预组与对照组比较，梗死体积的变化没有统计学差异(P>0.05，表1)。表1各组大鼠脑梗死体积的比较
2.2各组HE染色的病理特点光镜下观察假手术组海马CA1区神经元排列整齐，核膜清楚，核仁明显，未见神经变性、坏死等病理改变。对照组海马CA1区神经元分布不均，可见胞体皱缩，胞质浓缩，核固缩深染。干预组海马CA1区神经元形态介于上述两组之间(图1)。
2.3各组海马CA1区nNOS阳性细胞数的比较镜下观察见假手术组海马锥体细胞层有散在分布的nNOS阳性细胞，以胞质染色为主。对照组及干预组均见散在分布的nNOS阳性细胞(图2)，且阳性细胞数均增加，12h组表达最高，24h组较12h组有所下降，各组与假手术组比较有统计学差异(P<0.01)。干预组海马CA1区阳性细胞数与对照组比较均明显下降，与对照组比较有统计学差异(P<0.01，表2)。表2各组大鼠海马CA1区nNOS阳性细胞数的比较与对照组各相应时间点相比，*P<0.01;与假手术组相比，ΔP<0.01。图1不同组海马CA1区HE染色的病理改变Fig.1 Histopathological changes of CA1 hippocampal neurons in different groups (HE, ×400)A：假手术组;B：2h对照组;C：2h干预组。〖2〗A：假手术组; B：2h对照组;C：12h对照组;D：24h对照组;E：2h干预组;F：12h干预组;G：24h干预组。图2海马CA1区的nNOS阳性细胞的免疫组化染色Fig.2 The nNOS-positive cells in the hippocampus CA1(×400)
3讨论
NO以L-精氨酸为底物，在NOS催化作用下生成，是一种重要的信使分子，参与多种疾病的病理生理过程。NO在中枢神经系统中具有两重作用[5]：一方面具有神经介质传递信息的作用和血管扩张作用，另一方面具有神经毒性作用。nNOS主要存在于神经细胞，尤其是小脑神经元中，脑缺血后过度表达的nNOS在神经细胞早期损伤中起关键作用[6]，其损伤机制可能是nNOS表达上调，产生大量NO，进而产生大量自由基，损伤线粒体及DNA，诱导细胞凋亡，产生神经毒性作用[6]。因此，nNOS及NO在脑缺血中的作用越来越受到关注。
本实验选择对脑缺血相对较敏感的海马区，观察脑缺血后海马CA1区nNOS表达的变化，发现缺血2h组nNOS表达升高，12h组进一步升高，24h组较前下降，与假手术组相比有统计学差异(P<0.01)，提示nNOS介导脑缺血早期的损伤，并表现为先升高、后有所下降的趋势。杨卫忠等[7]研究显示nNOS mRNA在缺血0.5～6h呈高表达，nNOS基因在脑缺血早期表达，nNOS主要在神经细胞胞质中表达，脑缺血发生后即有短暂的NO增高，主要由神经元的nNOS及血管内皮的nNOS介导。国外学者用免疫组化的方法检查大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型缺血部位见nNOS的神经元数量在4h增至高峰，24h开始减退，约7d后回到缺血前水平[8]。而在长时间的脑缺血模型中，也可检测到nNOS mRNA表达的增加[9]。脑缺血后期nNOS活性的下降与快速升高的NO有关。NO可以使nNOS中巯基亚硝基化，导致nNOS活性下降。
葛根素是从葛根中提取的一种异黄酮类化合物，对脑缺血性损伤具有较好的脑保护作用。我们先前的实验亦证明葛根素可提高缺血脑组织细胞内氧浓度达到脑保护作用[10]。本实验结果表明，12h内给予葛根素干预能够明显减小脑梗死体积，24h后葛根素干预脑梗死体积虽有所减小。但是，与模型对照组相比无统计学差异。神经保护的主要目的是挽救缺血半暗带，如果半暗带区域的神经细胞得到救治，梗死区域将不会扩大。由此我们可以推测脑梗死后早期应用葛根素能够挽救缺血半暗带内的细胞，从而明显地减少梗死体积，起到神经保护作用。
本实验结果表明，应用葛根素后海马CA1区nNOS表达减少，提示葛根素可能通过抑制海马nNOS的表达，对脑组织起保护作用。nNOS的波动将引起细胞内NO的波动;而王姿颖等[11]和谭军等[12]均报道在大鼠模型中可见葛根素通过降低缺血再灌注区脑组织NO的含量而对缺血再灌注脑损伤发挥保护作用。因此，葛根素干预后细胞内nNOS表达的抑制应是其脑保护的一重要机制。但是，它究竟是通过何种途径减少nNOS的表达，从而拮抗NO的毒性作用，尚需进一步研究。
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